Comparative evaluation of macro- and micromethods of serological diagnosis of salmonellosis and shigellosis in the hemagglutination reaction

D. M. Sharifullina; Шарифуллина Д. М.; N. Z. Shagidullina; Шагидуллина Н. З.; G. N. Lapshina; Лапшина Г. Н.; N. Y. Kuryaeva; Куряева Н. Ю.

doi:10.17816/kazmj65019

Comparative evaluation of macro- and micromethods of serological diagnosis of salmonellosis and shigellosis in the hemagglutination reaction

Authors: Sharifullina D.M.¹^,2, Shagidullina N.Z.¹^,2, Lapshina G.N.¹^,2, Kuryaeva N.Y.¹^,2
Affiliations:
1. Kazan city diagnostic center for laboratory diagnostics of infectious diseases
2. Kazan State Medical Academy of Postgraduate Education
Issue: Vol 79, No 6 (1998)
Pages: 461-465
Section: Articles
URL: https://kazanmedjournal.ru/kazanmedj/article/view/65019
DOI: https://doi.org/10.17816/kazmj65019
ID: 65019

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

When studying the possibility of using the same antigenic erythrocyte diagnosticum for staging the hemagglutination reaction (RIGA) by macro and micromethods for various infections, the results of RIGA obtained by the classical macro method and the modified micromethod using the Tokachi system microtiter were compared.

Keywords

Kazan Medical archive

Full Text

При изучении возможности использования одного и того же антигенного эритроцитарного диагностикума для постановки реакции гемагглютинации (РИГА) макро-и микрометодами при различных инфекциях были сопоставлены результаты РИГА, полученные классическим макрометодом и модифицированным микрометодом с использованием микротитратора системы Токачи [4, 5]. Были испытаны эритроцитарные диагностикумы дифтерийный, столбнячный, клостридиозный, стафилококковый, чумной, туляремийный, вирусов осповакцины и кори. Результаты обоих методов совпали. Микрометод позволил сократить расход всех ингредиентов реакции в 6— 1.0 раз, оказался намного производительнее и, как правило, не уступал макрометоду по чувствительности.

В связи с ухудшением экономических условий в нашей стране актуален вопрос об экономии ингредиентов и возможности использования микрометода при постановке РИГА с сальмонеллезными и шигеллезными эритроцитарными диагностикумами, предназначенными для макрометода.

Целью наших исследований было изучение возможности постановки РИГА микрометодом при серодиагностике сальмонеллезов и шигеллезов с антигенными эритроцитарными диагностикумами, разработанными для макрометода. Попутно надо было решить вопрос о необходимости и целесообразности предварительной обработки исследуемых сывороток больных перед постановкой РИГА. Сыворотки больных могут содержать неспецифические гемагглютини-ны (вещества липоидной природы, нормальные антитела к эритроцитам барана и др.), которые способны негативно повлиять на результаты анализа и давать ложноположительные реакции.

Исследование проводилось в четыре этапа. На первом — определяли активность и специфичность эритроцитарных диагнос-тикумов в присутствии референс-сывороток (диагностических сальмонеллезных и шигеллезных, входящих в комплект эритроцитарных диагностикумов). Реакцию ставили макро- и микрометодами с последующим сопоставлением результатов. Это давало нам возможность одновременно оценивать эффективность макро- и микрометода на заведомо положительных сыворотках.

На втором этапе решали вопрос о необходимости обработки сывороток больных с подозрением на сальмонеллез и шигеллез. Обработку производили путем прогревания и истощения сывороток несенсибилизированными эритроцитами для удаления неспецифических гемагглютининов. Результаты исследований обработанных и необработанных сывороток сопоставляли в РНГА, поставленной с помощью макро- и микрометодами.

На третьем этапе исследовали только обработанные сыворотки больных с сопоставлением результатов макро- и микрометодов. На четвертом этапе подобным образом изучали только необработанные сыворотки.

РНГА при микрометоде ставили в полистироловых пластинках с Ѵ-образными лунками, в которые вносили по 0,05 мл растворителя (0,85% раствора натрия хлорида, pH 7,2), начиная с первой лунки до шестой. В первую лунку добавляли 0,05 мл исследуемой сыворотки, разведенной 1:50; после тщательного перемешивания получали разведение 1:100, и 0,05 мл этого разведения переносили во вторую лунку. Далее готовили последующие двукратные разведения сыворотки от 1:100 до 1:3200. Во все опытные лунки вносили по 0,025 мл 1% взвеси эритроцитарного антигенного диагностикума. Реакцию контролировали путем испытания эритроцитарного диагностикума на отсутствие спонтанной агглютинации в двух лунках (по 0,05 мл растворителя и 0,025 мл эритроцитарного диагностикума), сывороток больных на отсутствие неспецифических гемагглютининов (в двух лунках готовили разведения сыворотки 1:100 и 1:200 в объеме 0,5 и вносили в них по 0,025 мл 1% взвесь несенсибилизированных эритроцитов), а также диагностической сыворотки, разведенной с 1:100 до титра или удвоенного титра, указанного на этикетке ампулы, для контроля активности и специфичности эритроцитарных диагностикумов.

До недавнего времени эритроцитарные диагностикумы считали специфически активными, если они агглютинировались соответствующими диагностическими сыворотками до 1/ 2 титра или до одного титра этих сывороток (то есть допускались колебания титра в 2 раза). В настоящее время, например, в “Инструкции по применению эритроцитарного антигенного дифтерийного диагностикума” [3], при определении специфической активности диагностикума допускается колебание от 1/ 4 до 1 титра референс-сыворотки, то есть колебание титра в 4 раза. В связи с этим диагностические сыворотки мы титровали в 9 лунках с разведением от 1:100 до 1:25600 при титре сыворотки 1:12800. Диагностикумы считали активными и специфичными, если они агглютинировались в диапазоне трех разведений: 1/ 4 — 1/ 2 — 1 титр или 1/ 2 — 1—2 титра. Колебания титра сывороток в 2 и 4 раза лежат в пределах допустимой ошибки.

Для перемешивания ингредиентов пластины постукивали по углам, и реакцию проводили при температурном и временном режимах, указанных в инструкциях. Учет результатов проводили по 4-плюсовой шкале. Титром сыворотки считали то последнее ее разведение, в котором еще наблюдалась гемагглютинация не менее чем на три плюса.

Обработку сыворотки больных для исключения неспецифической гемагглютинации проводили общепринятыми методами (прогреванием на водяной бане при 56°С 30 минут и адсорбцией несенсибилизированными эритроцитами при 4°С 18—20 часов).

На первом этапе исследования активность и специфичность эритроцитарных диагностикумов были определены на 9 диагностических сыворотках. Было поставлено 125 опытов параллельно макро- и микрометодами, из них 69 — с сальмонеллезными эритроцитарными диагностикумами и 56 — с шигеллезными. В целом было проведено 250 исследований. Все эритроцитарные диагностикумы оказались активными и специфичными. Они агглютинировались соответствующими сыворотками до 1/ 2 титра, до одного титра или удвоенного титра. Только в 5 случаях эритроцитарные диагностикумы агглютинировались до 1/ 4 титра (в основном сальмонеллезные) при постановке РНГА микрометодом. Эти диагностикумы агглютинировались в РИГА макрометодом до 1/ 2 титра сыворотки (таблица 1).

Таблица 1. Сравнительная оценка макро- и микрометодов при исследовании заведомо положительных диагностических сывороток в РИГА

Методы постановки РИГА	Всего опытов	Из них положительных РНГА до
Методы постановки РИГА	Всего опытов	до 1/ 2 титра	до 1 титра	до удвоенного титра	до 1/ 4 титра
Макрометод	125	33 (26,0%)	88 (70,4%)	4 (3,2%)	—
Микрометод	125	33 (26,4%)	76 (60,8%)	11 (8,8%)	5 (4,0%)

Таким образом, при постановке РИГА с заведомо положительными диагностическими сыворотками микрометодом отклонения от титра в ту или другую сторону регистрировались чаще (12,8±3,0%), чем при макрометоде (3,2±1,5%; Р=0,01). При микрометоде число положительных РИГА до удвоенного титра диагностических сывороток было выше (8,8±2,5%), чем при макрометоде (3,2±1,5%; Р=0,05). Положительные реакции до 1/ 4 титра регистрировались только при микрометоде (4,0±1,8%).

Мы не смогли подтвердить выводы, сделанные в “Инструкции по применению псевдотуберкулезного эритроцитарного антигенного диагностикума” [2] о том, что при постановке реакции микрометодом титры сывороток бывают обычно на одно разведение ниже.

При более детальном сопоставлении результатов 125 параллельных опытов, поставленных макро- и микрометодами, полное совпадение титров было получено в 99 опытах (79,2±3,6%). В 16 (12,8±3,0%) опытах титры сывороток были ниже на одно разведение и в 10 (8,0±2,4%) — выше на одно разведение при микрометоде по сравнению с результатами, полученными макрометодом. Эти колебания в 2 раза лежат в пределах допустимой ошибки.

В опытах с диагностическими заведомо положительными сыворотками нам не удалось выявить существенной разницы в колебаниях титров с шигеллезными и сальмо-неллезными диагностикумами. Так, при постановке РИГА с шигеллезными антигенами (56 опытов) несовпадения титров при макро- и микрометодах выявлены в 17,9±5,1% случаев, с сальмонеллезными антигенами (69 опытов) — в 23,2±5,1%. Статистически достоверной разницы не было (таблица 2).

Таблица 2. Результаты исследования в РИГА заведомо положительных (диагностических) сывороток с различными эритроцитарными диагностикумами макро- и микрометодами

Диагностические сыворотки	Проведено опытов	Титры антител при макро- и микрометодах			Специфическая активность эритроцитарных диагностикумов в присутствии диагностических сывороток
		полное совпадение разведения	титры при микрометоде		при макрометоде			при микрометоде
		полное совпадение разведения	ниже на одно разведение	выше на одно разведение	до 2 титров	до 1 титра	до ½ титра	до 2 титров	до 1 титра	до ½ титра	до ¼ титра
К шигеллам:
Зонне	18	13	4	1	_	16	2	2	12	4	_
Флекснера	18	15	3	—	—	15	3	—	13	4	1
Ньюкестла	20	18	1	1	—	19	1	—	19	1	—
К сальмонеллам:
гр. А	13	9	2	2	4	9	—	5	7	1	—
гр. В	13	12	1	—	—	2	11	—	2	10	1
гр. С1	12	8	2	2	—	3	9	—	4	7	1
гр. С2	5	3	2	—	—	—	5	—	—	3	2
гр. Д	13	10	1	2	—	12	1	2	9	2	—
гр. Е	13	11	—	2	—	12	1	2	10	1	—
Итого	125	99	16	10	4	88	33	11	76	33	5

Наиболее часто агглютинация до удвоенного титра диагностической сыворотки наблюдалась с сальмонеллезными эритроцитарными диагностикумами как с помощью макро-, так и микрометода (соответственно в 5,8±4,8% и 13,0±4,0%) по сравнению с шигеллезными (от 0 до 3,5±2,5%). Это можно объяснить, по-видимому, более низкой специфичностью сальмонеллезных диагностикумов или же тем, что диагностические сальмонеллезные сыворотки выпускаются с титрами, превышающими указанные на этикетках ампул.

Итак, в результате исследования заведомо положительных диагностических сальмонеллезных и шигеллезных сывороток можно сделать вывод, что эритроцитарные антигенные сальмонеллезные и шигеллезные диагностикумы, предназначенные для макрометода, можно использовать и для микрометода.

На втором этапе исследования решался вопрос о необходимости предварительной обработки сывороток больных прогреванием и истощением несенсибилизированными эритроцитами перед постановкой РИГА. В последующем обработанную и необработанную сыворотки исследовали макро- и микрометодами. Было поставлено 249 опытов, из них 97 — с сальмонеллезным эритроцитарным диагностикумом и 152 — с шигеллезным. Макрометодом параллельно исследовали обработанные и необработанные сыворотки, полученные у 54 больных с подозрением на сальмонеллез и шигеллез. В необработанных пробах положительными оказались 53 сыворотки (98,1±1,8%), а в обработанных — 36 (66,6±6,9%). Следовательно, обработка сывороток снижала процент положительных находок на 31,5% (Р <0,01).

Наибольшее снижение наблюдалось в опытах с сальмонеллезными диагностикумами, которые, по нашему мнению, менее специфичны, поэтому истощение сывороток несенсибилизированными эритроцитами, по-видимому, приводило к удалению из сывороток не только неспецифических, но и специфических гемагглютининов. Так, в 34 необработанных пробах антитела к сальмонеллам были обнаружены в 100% случаев, а в обработанных— только в 61,7±3,3%, то есть наблюдалось снижение титра на 38,3% (Р <0,001). Из 20 опытов с шигеллезными диагностикумами в необработанных пробах антитела обнаружены в 19 (95,0±5,0%), а в обработанных — в 15 (75,0±9,9%), то есть снижение выявлено на 20% (Р> 0,5). Микрометодом параллельно исследовали обработанные и необработанные сыворотки от 247 больных, из них в необработанных пробах антитела к сальмонеллам и шигеллам обнаружились в 156 случаях (63,1±9,4%), а в обработанных — в 112 (45,3±10,0%). Обработка сыворотки снижала показатели положительных находок на 17,8% (Р> 0,1). С сальмонеллезными диагностикумами было поставлено 97 опытов. В необработанных сыворотках положительными оказались 48 (49,4±5,0%) результатов, а в обработанных — 38 (39,1±4,9%). Таким образом, обработка снижала показатель положительных находок на 10,3% (Р> 0,1).

С шигеллезными диагностикумами было поставлено 150 опытов, из них в необработанных сыворотках антитела обнаружились в 108 пробах (72,0±3,6%), а в обработанных — в 74 (49,0±4,1%). Снижение положительных находок — на 22,7% (Р <0,001). Обработка сывороток приводила к более резкому снижению положительных находок при постановке реакции макрометодом (31,5±6,3%) по сравнению с результатами, полученными микрометодом (17,8±2,4%; Р=0,5). Такое

явление можно объяснить известной закономерностью: чем больше объем сывороток (и антигенов), используемый в исследовании, тем более точными получаются результаты. В этом смысле микрометод, конечно, уступает макрометоду.

Снижение титров антител в обработанных сыворотках обычно объясняют удалением неспецифических гемагглютининов. Однако таковые в наших анализах были обнаружены только в 4 пробах. Следовательно, обработка сывороток приводит к удалению специфических гемагглютининов, что, конечно, недопустимо.

Исходя из изложенного выше, мы пришли к выводу, что при постановке РИГА при серодиагностике сальмонеллезов и шигеллезов исследуемые сыворотки не должны прогреваться и истощаться. Такой обработке нужно подвергать только сыворотки, которые в контроле на неспецифические гемагглютинины дают положительную реакцию. Это заключение согласуется с выводами Ю.Л. Горчакова [1], который определял неспецифические гемагглютинины (гетерофильные антитела) в сыворотках больных ОКЗ.

На третьем этапе исследования оценивали результаты РИГА, полученные макро-и микрометодами только в обработанных сыворотках больных. Всего было исследовано 377 сывороток параллельно макро- и микрометодами. Из них при макрометоде антитела были выявлены в 58 сыворотках (15,3±1,8%), а при микрометоде — в 68 (18,0±1,9%). Разницы в показателях не обнаружено (Р> 0,1). Полное совпадение положительных результатов в величине титров при постановке РИГА макро- и микрометодами наблюдалось прежде всего с шигеллезными эритроцитарными диагностикумами (из 47 положительных сывороток полное совпадение титров наблюдалось в 44 случаях, то есть в 93,6±3,6%), а также с сальмо-неллезными групповыми диагностикумами (из 20 положительных сывороток полное совпадение титров имело место в 19 случаях, то есть в 95,0±5,0%).

Несколько иные результаты были получены при постановке РИГА с сальмонеллезным комплексным эритроцитарным диагностикумом. Число положительных находок при микрометоде было в 3 раза выше, чем при макрометоде, но все эти несовпадения были обусловлены первым разведением сыворотки (1:100), которое диагностического значения не имеет. Считаем, что решающая роль в серодиагностике сальмонеллезных заболеваний принадлежит групповым диагностикумам, которые дали в наших исследованиях высокий процент совпадения результатов (95,0±5,0%).

На четвертом этапе определяли результаты РНГА, полученные макро- и микрометодами только в необработанных сыворотках больных. Всего было исследовано 127 сывороток обоими методами: положительные результаты были получены в 61 опыте (48,0±4,4%), при этом макрометодом — в 54 (42,5±4,5%), а микрометодом — в 57 (44,8±4,4%). Статистически достоверной разницы не было. Полное совпадение титров при макро и микрометодах наблюдалось в 28 случаях (45,9±6,4%). Несовпадения были зарегистрированы в 33 опытах (54,1±6,4%), из них на одно разведение — в 26 (42,6±6,3%), на два — в 7 (11,5±4,1%). При микрометоде одинаково часто наблюдалось и повышение (45,0±8,7%), и понижение (54,5±8,7%) титра по сравнению с результатами макрометода как при сальмонеллезе, так и при шигеллезе. Зарегистрированные несовпадения в титрах на 1—2 разведения лежат в пределах допустимой ошибки.

Несколько лучшие показатели были получены при исследовании сывороток больных на сальмонеллез. Из 23 положительных РНГА полное совпадение титров обнаружено в 14 (60,9±10,4%) случаях, несовпадения — в 9 (39,1±10,4%), в том числе на одно разведение — в 8 (34,8±10,2%), на два — в одном (4,3±4,3%).

При шигеллезах из 38 положительных РИГА совпадение титров наблюдалось в 14 случаях (63,2±7,8%), при этом на одно разведение — в 18 случаях (47,4±8,1%), на 2 — в 6 (15,8±5,9%). Статистически достоверной разницы в результатах постановки РНГА макро- и микрометодом при сальмонеллезе и шигеллезе не наблюдалось (Р>0,5). Все случаи несовпадения макро- и микрометодов были схожи с таковыми при исследовании заведомо положительных диагностических сывороток, то есть были в пределах допустимых колебаний.

Выводы

Сальмонеллезные и шигеллезные антигенные эритроцитарные диагностикумы, предназначенные для постановки РИГА макрометодом, можно использовать и для микрометода.
Перед постановкой РНГА сыворотки больных с подозрением на сальмонеллез и шигеллез обрабатывать нецелесообразно, так как при этом резко снижаются титры не только неспецифических, но и специфических гемагглютининов. Обработке следует подвергать только такие сыворотки, в контроле которых обнаруживаются неспецифические гемагглютинины.
При исследовании в РИГА необработанных сывороток рекомендуется ставить контроль в 3—4 разведениях (в 3—4 лунках), так как в первых двух разведениях (лунках) неспецифическая гемагглютинация может отсутствовать из-за возможного содержания неполных нормальных антител (прозоне), а в последующих — она может проявиться.
При постановке РИГА макро- и микометодами титры антител одних и тех же сывороток (у больных и диагностических) могут колебаться в 2—4 раза, и эти колебания лежат в пределах допустимой ошибки, поэтому для установления серологического диагноза следует исследовать парные сыворотки у больных в динамике заболевания. Диагностическое значение имеет только нарастание или падение титра антител более чем в 4 раза.