Сравнительная оценка макро-и микрометодов серологической диагностики сальмонеллезов и шигеллезов в реакции гемагглютинации

Полный текст

При изучении возможности использования одного и того же антигенного эритроцитарного диагностикума для постановки реакции гемагглютинации (РИГА) макро-и микрометодами при различных инфекциях были сопоставлены результаты РИГА, полученные классическим макрометодом и модифицированным микрометодом с использованием микротитратора системы Токачи [4, 5]. Были испытаны эритроцитарные диагностикумы дифтерийный, столбнячный, клостридиозный, стафилококковый, чумной, туляремийный, вирусов осповакцины и кори. Результаты обоих методов совпали. Микрометод позволил сократить расход всех ингредиентов реакции в 6— 1.0 раз, оказался намного производительнее и, как правило, не уступал макрометоду по чувствительности.

В связи с ухудшением экономических условий в нашей стране актуален вопрос об экономии ингредиентов и возможности использования микрометода при постановке РИГА с сальмонеллезными и шигеллезными эритроцитарными диагностикумами, предназначенными для макрометода.

Целью наших исследований было изучение возможности постановки РИГА микрометодом при серодиагностике сальмонеллезов и шигеллезов с антигенными эритроцитарными диагностикумами, разработанными для макрометода. Попутно надо было решить вопрос о необходимости и целесообразности предварительной обработки исследуемых сывороток больных перед постановкой РИГА. Сыворотки больных могут содержать неспецифические гемагглютини-ны (вещества липоидной природы, нормальные антитела к эритроцитам барана и др.), которые способны негативно повлиять на результаты анализа и давать ложноположительные реакции.

Исследование проводилось в четыре этапа. На первом — определяли активность и специфичность эритроцитарных диагнос-тикумов в присутствии референс-сывороток (диагностических сальмонеллезных и шигеллезных, входящих в комплект эритроцитарных диагностикумов). Реакцию ставили макро- и микрометодами с последующим сопоставлением результатов. Это давало нам возможность одновременно оценивать эффективность макро- и микрометода на заведомо положительных сыворотках.

На втором этапе решали вопрос о необходимости обработки сывороток больных с подозрением на сальмонеллез и шигеллез. Обработку производили путем прогревания и истощения сывороток несенсибилизированными эритроцитами для удаления неспецифических гемагглютининов. Результаты исследований обработанных и необработанных сывороток сопоставляли в РНГА, поставленной с помощью макро- и микрометодами.

На третьем этапе исследовали только обработанные сыворотки больных с сопоставлением результатов макро- и микрометодов. На четвертом этапе подобным образом изучали только необработанные сыворотки.

РНГА при микрометоде ставили в полистироловых пластинках с Ѵ-образными лунками, в которые вносили по 0,05 мл растворителя (0,85% раствора натрия хлорида, pH 7,2), начиная с первой лунки до шестой. В первую лунку добавляли 0,05 мл исследуемой сыворотки, разведенной 1:50; после тщательного перемешивания получали разведение 1:100, и 0,05 мл этого разведения переносили во вторую лунку. Далее готовили последующие двукратные разведения сыворотки от 1:100 до 1:3200. Во все опытные лунки вносили по 0,025 мл 1% взвеси эритроцитарного антигенного диагностикума. Реакцию контролировали путем испытания эритроцитарного диагностикума на отсутствие спонтанной агглютинации в двух лунках (по 0,05 мл растворителя и 0,025 мл эритроцитарного диагностикума), сывороток больных на отсутствие неспецифических гемагглютининов (в двух лунках готовили разведения сыворотки 1:100 и 1:200 в объеме 0,5 и вносили в них по 0,025 мл 1% взвесь несенсибилизированных эритроцитов), а также диагностической сыворотки, разведенной с 1:100 до титра или удвоенного титра, указанного на этикетке ампулы, для контроля активности и специфичности эритроцитарных диагностикумов.

До недавнего времени эритроцитарные диагностикумы считали специфически активными, если они агглютинировались соответствующими диагностическими сыворотками до 1/ 2 титра или до одного титра этих сывороток (то есть допускались колебания титра в 2 раза). В настоящее время, например, в “Инструкции по применению эритроцитарного антигенного дифтерийного диагностикума” [3], при определении специфической активности диагностикума допускается колебание от 1/ 4 до 1 титра референс-сыворотки, то есть колебание титра в 4 раза. В связи с этим диагностические сыворотки мы титровали в 9 лунках с разведением от 1:100 до 1:25600 при титре сыворотки 1:12800. Диагностикумы считали активными и специфичными, если они агглютинировались в диапазоне трех разведений: 1/ 4 — 1/ 2 — 1 титр или 1/ 2 — 1—2 титра. Колебания титра сывороток в 2 и 4 раза лежат в пределах допустимой ошибки.

Для перемешивания ингредиентов пластины постукивали по углам, и реакцию проводили при температурном и временном режимах, указанных в инструкциях. Учет результатов проводили по 4-плюсовой шкале. Титром сыворотки считали то последнее ее разведение, в котором еще наблюдалась гемагглютинация не менее чем на три плюса.

Обработку сыворотки больных для исключения неспецифической гемагглютинации проводили общепринятыми методами (прогреванием на водяной бане при 56°С 30 минут и адсорбцией несенсибилизированными эритроцитами при 4°С 18—20 часов).

На первом этапе исследования активность и специфичность эритроцитарных диагностикумов были определены на 9 диагностических сыворотках. Было поставлено 125 опытов параллельно макро- и микрометодами, из них 69 — с сальмонеллезными эритроцитарными диагностикумами и 56 — с шигеллезными. В целом было проведено 250 исследований. Все эритроцитарные диагностикумы оказались активными и специфичными. Они агглютинировались соответствующими сыворотками до 1/ 2 титра, до одного титра или удвоенного титра. Только в 5 случаях эритроцитарные диагностикумы агглютинировались до 1/ 4 титра (в основном сальмонеллезные) при постановке РНГА микрометодом. Эти диагностикумы агглютинировались в РИГА макрометодом до 1/ 2 титра сыворотки (таблица 1).

 

Таблица 1. Сравнительная оценка макро- и микрометодов при исследовании заведомо положительных диагностических сывороток в РИГА

Методы постановки РИГА	Всего опытов	Из них положительных РНГА до
		до 1/ 2 титра	до 1 титра	до удвоенного титра	до 1/ 4 титра
Макрометод	125	33 (26,0%)	88 (70,4%)	4 (3,2%)	—
Микрометод	125	33 (26,4%)	76 (60,8%)	11 (8,8%)	5 (4,0%)

 

Таким образом, при постановке РИГА с заведомо положительными диагностическими сыворотками микрометодом отклонения от титра в ту или другую сторону регистрировались чаще (12,8±3,0%), чем при макрометоде (3,2±1,5%; Р=0,01). При микрометоде число положительных РИГА до удвоенного титра диагностических сывороток было выше (8,8±2,5%), чем при макрометоде (3,2±1,5%; Р=0,05). Положительные реакции до 1/ 4 титра регистрировались только при микрометоде (4,0±1,8%).

Мы не смогли подтвердить выводы, сделанные в “Инструкции по применению псевдотуберкулезного эритроцитарного антигенного диагностикума” [2] о том, что при постановке реакции микрометодом титры сывороток бывают обычно на одно разведение ниже.

При более детальном сопоставлении результатов 125 параллельных опытов, поставленных макро- и микрометодами, полное совпадение титров было получено в 99 опытах (79,2±3,6%). В 16 (12,8±3,0%) опытах титры сывороток были ниже на одно разведение и в 10 (8,0±2,4%) — выше на одно разведение при микрометоде по сравнению с результатами, полученными макрометодом. Эти колебания в 2 раза лежат в пределах допустимой ошибки.

В опытах с диагностическими заведомо положительными сыворотками нам не удалось выявить существенной разницы в колебаниях титров с шигеллезными и сальмо-неллезными диагностикумами. Так, при постановке РИГА с шигеллезными антигенами (56 опытов) несовпадения титров при макро- и микрометодах выявлены в 17,9±5,1% случаев, с сальмонеллезными антигенами (69 опытов) — в 23,2±5,1%. Статистически достоверной разницы не было (таблица 2).

 

Таблица 2. Результаты исследования в РИГА заведомо положительных (диагностических) сывороток с различными эритроцитарными диагностикумами макро- и микрометодами

Диагностические сыворотки	Проведено опытов	Титры антител при макро- и микрометодах			Специфическая активность эритроцитарных диагностикумов в присутствии диагностических сывороток
		полное совпадение разведения	титры при микрометоде		при макрометоде			при микрометоде
			ниже на одно разведение	выше на одно разведение	до 2 титров	до 1 титра	до ½ титра	до 2 титров	до 1 титра	до ½ титра	до ¼ титра
К шигеллам:
Зонне	18	13	4	1	_	16	2	2	12	4	_
Флекснера	18	15	3	—	—	15	3	—	13	4	1
Ньюкестла	20	18	1	1	—	19	1	—	19	1	—
К сальмонеллам:
гр. А	13	9	2	2	4	9	—	5	7	1	—
гр. В	13	12	1	—	—	2	11	—	2	10	1
гр. С1	12	8	2	2	—	3	9	—	4	7	1
гр. С2	5	3	2	—	—	—	5	—	—	3	2
гр. Д	13	10	1	2	—	12	1	2	9	2	—
гр. Е	13	11	—	2	—	12	1	2	10	1	—
Итого	125	99	16	10	4	88	33	11	76	33	5

 

Наиболее часто агглютинация до удвоенного титра диагностической сыворотки наблюдалась с сальмонеллезными эритроцитарными диагностикумами как с помощью макро-, так и микрометода (соответственно в 5,8±4,8% и 13,0±4,0%) по сравнению с шигеллезными (от 0 до 3,5±2,5%). Это можно объяснить, по-видимому, более низкой специфичностью сальмонеллезных диагностикумов или же тем, что диагностические сальмонеллезные сыворотки выпускаются с титрами, превышающими указанные на этикетках ампул.

Итак, в результате исследования заведомо положительных диагностических сальмонеллезных и шигеллезных сывороток можно сделать вывод, что эритроцитарные антигенные сальмонеллезные и шигеллезные диагностикумы, предназначенные для макрометода, можно использовать и для микрометода.

На втором этапе исследования решался вопрос о необходимости предварительной обработки сывороток больных прогреванием и истощением несенсибилизированными эритроцитами перед постановкой РИГА. В последующем обработанную и необработанную сыворотки исследовали макро- и микрометодами. Было поставлено 249 опытов, из них 97 — с сальмонеллезным эритроцитарным диагностикумом и 152 — с шигеллезным. Макрометодом параллельно исследовали обработанные и необработанные сыворотки, полученные у 54 больных с подозрением на сальмонеллез и шигеллез. В необработанных пробах положительными оказались 53 сыворотки (98,1±1,8%), а в обработанных — 36 (66,6±6,9%). Следовательно, обработка сывороток снижала процент положительных находок на 31,5% (Р <0,01).

Наибольшее снижение наблюдалось в опытах с сальмонеллезными диагностикумами, которые, по нашему мнению, менее специфичны, поэтому истощение сывороток несенсибилизированными эритроцитами, по-видимому, приводило к удалению из сывороток не только неспецифических, но и специфических гемагглютининов. Так, в 34 необработанных пробах антитела к сальмонеллам были обнаружены в 100% случаев, а в обработанных— только в 61,7±3,3%, то есть наблюдалось снижение титра на 38,3% (Р <0,001). Из 20 опытов с шигеллезными диагностикумами в необработанных пробах антитела обнаружены в 19 (95,0±5,0%), а в обработанных — в 15 (75,0±9,9%), то есть снижение выявлено на 20% (Р> 0,5). Микрометодом параллельно исследовали обработанные и необработанные сыворотки от 247 больных, из них в необработанных пробах антитела к сальмонеллам и шигеллам обнаружились в 156 случаях (63,1±9,4%), а в обработанных — в 112 (45,3±10,0%). Обработка сыворотки снижала показатели положительных находок на 17,8% (Р> 0,1). С сальмонеллезными диагностикумами было поставлено 97 опытов. В необработанных сыворотках положительными оказались 48 (49,4±5,0%) результатов, а в обработанных — 38 (39,1±4,9%). Таким образом, обработка снижала показатель положительных находок на 10,3% (Р> 0,1).

С шигеллезными диагностикумами было поставлено 150 опытов, из них в необработанных сыворотках антитела обнаружились в 108 пробах (72,0±3,6%), а в обработанных — в 74 (49,0±4,1%). Снижение положительных находок — на 22,7% (Р <0,001). Обработка сывороток приводила к более резкому снижению положительных находок при постановке реакции макрометодом (31,5±6,3%) по сравнению с результатами, полученными микрометодом (17,8±2,4%; Р=0,5). Такое

явление можно объяснить известной закономерностью: чем больше объем сывороток (и антигенов), используемый в исследовании, тем более точными получаются результаты. В этом смысле микрометод, конечно, уступает макрометоду.

Снижение титров антител в обработанных сыворотках обычно объясняют удалением неспецифических гемагглютининов. Однако таковые в наших анализах были обнаружены только в 4 пробах. Следовательно, обработка сывороток приводит к удалению специфических гемагглютининов, что, конечно, недопустимо.

Исходя из изложенного выше, мы пришли к выводу, что при постановке РИГА при серодиагностике сальмонеллезов и шигеллезов исследуемые сыворотки не должны прогреваться и истощаться. Такой обработке нужно подвергать только сыворотки, которые в контроле на неспецифические гемагглютинины дают положительную реакцию. Это заключение согласуется с выводами Ю.Л. Горчакова [1], который определял неспецифические гемагглютинины (гетерофильные антитела) в сыворотках больных ОКЗ.

На третьем этапе исследования оценивали результаты РИГА, полученные макро-и микрометодами только в обработанных сыворотках больных. Всего было исследовано 377 сывороток параллельно макро- и микрометодами. Из них при макрометоде антитела были выявлены в 58 сыворотках (15,3±1,8%), а при микрометоде — в 68 (18,0±1,9%). Разницы в показателях не обнаружено (Р> 0,1). Полное совпадение положительных результатов в величине титров при постановке РИГА макро- и микрометодами наблюдалось прежде всего с шигеллезными эритроцитарными диагностикумами (из 47 положительных сывороток полное совпадение титров наблюдалось в 44 случаях, то есть в 93,6±3,6%), а также с сальмо-неллезными групповыми диагностикумами (из 20 положительных сывороток полное совпадение титров имело место в 19 случаях, то есть в 95,0±5,0%).

Несколько иные результаты были получены при постановке РИГА с сальмонеллезным комплексным эритроцитарным диагностикумом. Число положительных находок при микрометоде было в 3 раза выше, чем при макрометоде, но все эти несовпадения были обусловлены первым разведением сыворотки (1:100), которое диагностического значения не имеет. Считаем, что решающая роль в серодиагностике сальмонеллезных заболеваний принадлежит групповым диагностикумам, которые дали в наших исследованиях высокий процент совпадения результатов (95,0±5,0%).

На четвертом этапе определяли результаты РНГА, полученные макро- и микрометодами только в необработанных сыворотках больных. Всего было исследовано 127 сывороток обоими методами: положительные результаты были получены в 61 опыте (48,0±4,4%), при этом макрометодом — в 54 (42,5±4,5%), а микрометодом — в 57 (44,8±4,4%). Статистически достоверной разницы не было. Полное совпадение титров при макро и микрометодах наблюдалось в 28 случаях (45,9±6,4%). Несовпадения были зарегистрированы в 33 опытах (54,1±6,4%), из них на одно разведение — в 26 (42,6±6,3%), на два — в 7 (11,5±4,1%). При микрометоде одинаково часто наблюдалось и повышение (45,0±8,7%), и понижение (54,5±8,7%) титра по сравнению с результатами макрометода как при сальмонеллезе, так и при шигеллезе. Зарегистрированные несовпадения в титрах на 1—2 разведения лежат в пределах допустимой ошибки.

Несколько лучшие показатели были получены при исследовании сывороток больных на сальмонеллез. Из 23 положительных РНГА полное совпадение титров обнаружено в 14 (60,9±10,4%) случаях, несовпадения — в 9 (39,1±10,4%), в том числе на одно разведение — в 8 (34,8±10,2%), на два — в одном (4,3±4,3%).

При шигеллезах из 38 положительных РИГА совпадение титров наблюдалось в 14 случаях (63,2±7,8%), при этом на одно разведение — в 18 случаях (47,4±8,1%), на 2 — в 6 (15,8±5,9%). Статистически достоверной разницы в результатах постановки РНГА макро- и микрометодом при сальмонеллезе и шигеллезе не наблюдалось (Р>0,5). Все случаи несовпадения макро- и микрометодов были схожи с таковыми при исследовании заведомо положительных диагностических сывороток, то есть были в пределах допустимых колебаний.

Выводы

1. Сальмонеллезные и шигеллезные антигенные эритроцитарные диагностикумы, предназначенные для постановки РИГА макрометодом, можно использовать и для микрометода.
2. Перед постановкой РНГА сыворотки больных с подозрением на сальмонеллез и шигеллез обрабатывать нецелесообразно, так как при этом резко снижаются титры не только неспецифических, но и специфических гемагглютининов. Обработке следует подвергать только такие сыворотки, в контроле которых обнаруживаются неспецифические гемагглютинины.
3. При исследовании в РИГА необработанных сывороток рекомендуется ставить контроль в 3—4 разведениях (в 3—4 лунках), так как в первых двух разведениях (лунках) неспецифическая гемагглютинация может отсутствовать из-за возможного содержания неполных нормальных антител (прозоне), а в последующих — она может проявиться.
4. При постановке РИГА макро- и микометодами титры антител одних и тех же сывороток (у больных и диагностических) могут колебаться в 2—4 раза, и эти колебания лежат в пределах допустимой ошибки, поэтому для установления серологического диагноза следует исследовать парные сыворотки у больных в динамике заболевания.  Диагностическое значение имеет только нарастание или падение титра антител более чем в 4 раза.

Об авторах

Д. М. Шарифуллина

Казанский городской диагностический центр по лабораторной диагностике инфекционных заболеваний; Казанская государственная медицинская академия последипломного образования

Автор, ответственный за переписку.
Email: info@eco-vector.com

Кафедра микробиологии

Россия, Казань; Казань

Н. З. Шагидуллина

Казанский городской диагностический центр по лабораторной диагностике инфекционных заболеваний; Казанская государственная медицинская академия последипломного образования

Email: info@eco-vector.com

Кафедра микробиологии

Россия, Казань; Казань

Г. Н. Лапшина

Казанский городской диагностический центр по лабораторной диагностике инфекционных заболеваний; Казанская государственная медицинская академия последипломного образования

Email: info@eco-vector.com

Кафедра микробиологии

Россия, Казань; Казань

Н. Ю. Куряева

Казанский городской диагностический центр по лабораторной диагностике инфекционных заболеваний; Казанская государственная медицинская академия последипломного образования

Email: info@eco-vector.com

Кафедра микробиологии

Россия, Казань; Казань

Список литературы

Дополнительные файлы