Proof of the oligomeric nature of fibrinogen b

Abstract

A study using chromatographic and immunochemical methods showed that fibrinogen B precipitated by ß-naphthol from the blood plasma of sick people has an oligomeric nature. These data, taking into account the chemical composition of fibrinogen B, suggest that fibrinogen B is a variant of soluble fibrin-monomer complexes. This determines the clinical significance of the ß-naphthol test as an express method for the diagnosis of thrombinemia.

Full Text

Исследование с применением хроматографического и иммунохимического методов показало, что фибриноген Б, осаждаемый ß-нафтолом из плазмы крови больных людей, имеет олигомерную природу. Эти данные с учетом химического состава фибриногена Б позволяют утверждать, что фибриноген Б пред­оставляет собой вариант растворимых комплексов фибрин-мономера. Это определяет клиническое значение пробы с ß-нафтолом как экспресс-метода диагностики тром­бинемии.

Ключевые слова: фибриноген Б, химическая природа.

2 рисунка. Библиография: 20 названий.

Фибриногеном Б называют белок, который осаждается из патологической плазмы крови при добавлении раствора ß-нафтола в этаноле. Фибриноген Б часто обнаружи­вается у больных с признаками внутрисосудистой активации свертывания крови [4, 7, 8 и др.], что позволяет использовать реакцию на фибриноген Б для диагностики типеркоагулемии.

Известно, что появление фибриногена Б в крови вызывается действием на фибри­ноген микроколичеств тромбина [2, 6] и образованием мономерного фибрина [3]. Электрофоретическое- исследование фибриногена Б показало, что его основу состав­ляет фибриноген [5], а анализ полипептидного спектра и N-концевых аминокислот позволил обнаружить в фибриногене Б 13 —18% мономерного фибрина с сохранен­ными фибринопептидами В.

Исходя из этих результатов, можно предположить, что фибриноген Б — это ра­створимые производные фибриногена, содержащие фибрин-мономер. Такие производ­ные, известные под названием растворимых комплексов фибрин-мономера (РКФМ), действительно обнаруживаются в крови больных людей [14, 17, 20]. Однако, чтобы окончательно подтвердить идентичность фибриногена Б и РКФМ, необходимо доказать олигомерную природу фибриногена Б, что и сделано в настоящей работе.

Кровь больных острым инфарктом миокарда брали из вены широкой иглой без шприца в пластиковую посуду и смешивали со стабилизатором в отношении 9 : 1 по объему. Состав стабилизатора: 0,1 М цитрат натрия, 0,02 М Nа2-ЭДТА, 500 КІ ед./мл; трасилола (Bayer, ФРГ). Бестромбоцитную плазму получали центрифугированием при 2500 ё в течение 20 мин при комнатной температуре.

Фибриноген Б осаждали из плазмы крови 2% раствором ß-нафтола в 50% эта­ноле, добавляя к 4 мл плазмы 0,6 мл реактива [12]. Образующийся осадок отделяли центрифугированием (600 g, 5 мин) и ресолюбилизировали в 3 мл фосфатно-цитратного буфера pH 7,2 при 37°С. Нерастворившуюся часть отделяли центрифугированием или фильтрованием через стеклянный фильтр.

Плазму или раствор фибриногена Б подвергали гель-хроматографии на Сефарозе 4В (Pharmacia Fine Chemicals Uppsala, Швеция). Размеры колонки — 2,5 X 90 СМ, объем наносимой пробы — 2 мл, рабочее давление — 30 см вод. ст., скорость то­ка — 10 мл/час, объем собираемых фракций — 3 мл. Свободный объем колонки, определенный по суспензии Е. coli, равен 81 мл. В качестве элюента использовали фосфатно-цитратный буфер pH 7,2, содержащий 0,05% азида натрия [11].

Анализ фракций проводили по поглощению при 280 нм. Для обнаружения в производных использовали реакцию торможения гемагглю­тинации таннизированных эритроцитов [18]. Кроличью сыворотку с антителами к фибриногену человека получа­ли по Кискеру и соавт. [16], фибриноген человека для иммунизации — методом Т. В. Варецкой [1]. Количество коагулируемого белка, определенное по методу Атенцио и соавт. [10], составляло 97,6%. В реакции иммунодиффузии в геле агара адсорбированная сыворотка была моноспецифичной (см. рис. 1).

Хроматография на геле агарозы стала распространенным методом выявления высокомолекулярных производных фибриногена и их препаративного выделения. В наших опытах хроматографии в стандартных условиях подверга­лись: 1) плазма, содержащая фибриноген Б; 2) фибриноген Б, осажденный из этой плазмы; 3) плазма, оставшаяся' после осаждения фибриногена Б; 4) контрольная плазма, не содержащая фибриногена Б. Результаты опытов пред­ставлены на рис. 2.

На рис. 2 А отчетливо видно, что исходная плазма больного инфарктом миокарда содержит производные фиб­риногена с большой молекулярной массой (пик 2), объем элюции которых меньше объема элюции фибриногена (со­ответственно 120 и 144 мл). Профиль элюции этой плаз­мы сходен с хроматографической кривой, полученной для

Именно эти производные являются наиболее важным компонентом фибриногена Б, опреде­ляющим его пониженную растворимость в присутствии этанола и ß-нафтола. С учетом данных о присутствии мономерного фибрина в составе фибриногена Б, а также об имму­нологическом родстве обнаруженных произ­водных с фибриногеном, можно заключить, что фибриноген Б — это растворимые ком­плексы фибрин-мономера, имеющие олигомер­ную природу.

В надосадке плазмы, остающемся после отделения фибриногена Б, РКФМ не обнару­живаются (см. рис. 2 В). Количество фибри­ногена, по данным РТГА, значительно умень­шается, а большая его часть осаждается с фибриногеном Б. Это подтверждает наши данные о вовлечении фибриногена в осадок под действием этанола и ß-нафтола [5]. Важ­но подчеркнуть, что в ходе реакции происхо­дит полное осаждение РКФМ и только частичное осаждение фибриногена. Это говорит о специфичности пробы с ß-шафтолом по отношению к РКФМ, хотя специфичность эта относительна.

Полученные данные в сочетании с резуль­татами изучения молекулярного состава фи­бриногена Б позволяют однозначно определить природу фибриногена Б и установить его идентичность с РКФМ. Растворы этих ком­плексов, имеющих олигомерное строение и большую молекулярную массу, обладают наи­меньшей термодинамической устойчивостью. При добавлении денатурирующих веществ (этанола, ß-нафтола) в концентрации, не до­статочной для осаждения фибриногена и дру­гих белков плазмы, РКФМ выпадают в осадок. При этом они увлекают за собой другие плаз­менные белки, которые взаимодействуют с РКФМ через нековалентные связи. Образова­ние этих связей в условиях гидрофобизации водного раствора и уменьшения его диэлектрической константы существенно облег­чается. Это приводит к соосаждению плазменных белков с РКФМ. Таким представля­ется механизм осаждения фибриногена Б, вытекающий из его олигомерной природы.