Determination of the activity of alkaline phosphatase of leukocytes
- Authors: Buhin A.I.1, Derviz G.V.1
-
Affiliations:
- Central Order of Lenin Institute of Hematology and Blood Transfusion
- Issue: Vol 49, No 6 (1968)
- Pages: 82-84
- Section: Articles
- URL: https://kazanmedjournal.ru/kazanmedj/article/view/61129
- DOI: https://doi.org/10.17816/kazmj61129
- ID: 61129
Cite item
Full Text
Abstract
Determination of the activity of alkaline phosphatase of leukocytes is of interest for the purposes of practical and theoretical medicine. In a number of diseases (acute inflammatory diseases, sepsis, leukemias, malignant tumors, radiation injuries, etc.), the activity of alkaline phosphatase of leukocytes often changes naturally, which can serve for differential diagnosis and prognosis.
Keywords
Full Text
Определение активности щелочной фосфатазы лейкоцитов представляет интерес для целей практической и теоретической медицины. При ряде заболеваний (острые воспалительные заболевания, сепсис, лейкозы, злокачественные опухоли, лучевые поражения и др.) активность щелочной фосфатазы лейкоцитов часто закономерно меняется, что может послужить для дифференциальной диагностики и прогноза.
Большинство исследований щелочной фосфатазы лейкоцитов базируется на применении в различных модификациях качественных цитохимических методов, хотя и удобных (легкость взятия, обработки и хранения мазка крови), но все же довольно субъективных.
Из биохимических количественных методик, преимуществом которых является возможность точного количественного учета полученных результатов, следует упомянуть модификации методик Боданского и Кея с применением в качестве субстрата ß-глицерофосфата натрия с последующим определением освободившегося фосфора. Мы пользовались методикой, разработанной Г. К. Шлыгиным и С. Я. Михлиным для определения щелочной фосфатазы в плазме крови. При этой методике применяется в качестве субстрата довольно доступный паранитрофенилфосфат натрия, и в результате воздействия фосфатазы на субстрат получается окрашенное вещество (паранитрофенол). Реакция идет в присутствии ионов Mg, которые являются активаторами щелочной фосфатазы. Получающийся в результате реакции паранитрофенол в щелочных растворах имеет желтую окраску. По интенсивности окраски судят о количестве освобожденного паранитрофенола, а отсюда — и об активности фермента, содержащегося в имеющемся количестве лейкоцитов. Для унификации результатов и возможности их сравнения с данными, полученными при других методах, мы предлагаем количество освобожденного паранитрофенола выражать в миллимолях и пересчитывать на І010 лейкоцитов. Реактивы, р-йи грофенилфосфат натрия или бария; 0,001 и. раствор НС1; водонасыщенный бутиловый спирт; водонасыщенный этиловый эфир; аммиачная буферная смесь: 1 н. раствор NH3, проверенный титрометрически, смешивают с 1 н. раствором NH4CI в соотношении 4 : 1 (pH—10,1); 0,3% раствор MgCl2; 5% раствор NaCl; 0,9% раствор NaCl; 0,3% раствор NaCl; 5% раствор секвестрена (динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты — ЭДТА-Na), готовится на горячем физиологическом растворе; 10% раствор желатины; р-нитрофенол для приготовления стандартных растворов; 0,1 н. раствор двузамещеиной соды (удобно брать безводный На2СОз).
Приготовление забуференного раствора субстрата. Приготовляют 0,45% раствор р-нитрофенилфосфата натрия в 0,001 н. соляной кислоте. Раствор хранится 3—6 дней, его следует готовить столько, чтобы израсходовать за это время. Полученный раствор желтого цвета (примесь р-нитрофенола) взбалтывают (для обесцвечивания) в делительной воронке с равным количеством водонасыщенного бутилового спирта. Разделив оба слоя, образовавшиеся в делительной воронке, водный слой обрабатывают еще 1—2 раза бутиловым спиртом, а затем 1—2 раза эфиром. Бутиловый и эфирный слои выливают. В результате такой обработки водный раствор р-нитрэфенилфосфата становится бесцветным. К полученному бесцветному раствору субстрата добавляют раствор аммиачного буфера из расчета 1 мл на каждые 9 мл субстрата (в смеси концентрация буфера равна 0,1 н., а концентрация субстрата 0,4%). Забуференный субстрат хранят в тщательно закрытом пробкой темном сосуде в холодильнике при 4° С. Если раствор при хранении окрашивается в желтый цвет, то он не годен и его заменяют свежим.
Если применяется р-нитрофенилфосфат бария, то в этом случае приготовляют 0,9% раствор препарата в 0,001 н. растворе НС1 (примеси в препарате составляют около 50%). Навеску берут из расчета 0,9 г препарата на 100 мл НС1 с тем, чтобы общее количество раствора соответствовало 3—6-дневной потребности. Полученный мутный раствор фильтруют, фильтрат переносят в делительную виронку и дальнейшие процедуры производят так же, как и при приготовлении забуференного субстрата р-нитрофенилфосфата натрия. Небольшой осадок, образующийся после добавления аммиачной буферной смеси, удаляют фильтрованием.
Приготовление стандартного щелочного раствора р-нитрофенола. Приготовляют 0,4 л/г% раствор р-нитрофенола в 0,1 н-растворе Na2COs. Удобно сначала приготовить этот раствор более концентрированным, взяв навеску 100 мг р-нитрофенола и растворив ее в 100 мл 0,1 н. раствора Nа2СОз (100 мг% раствор). Раствор должен стоять ночь или более, и затем часть его разводят в 250 раз 0,1 н. раствором соды.
Степень окрашивания стандартного' раствора после его приготовления проверяют на спектрофотометре СФ-4; оптическая плотность должна быть равна 0,520—0,530 в области 400 ммк при толщине слоя в 1 см и ширине щели 0,02 мм (в нашем случае она равнялась 0,525). Можно воспользоваться для этой же цели и фотоэлектрическим колориметром (модель ФЭК-М, 1953 г.). При измерении с синим светофильтром в кювете на 5 см светового пути оптическая плотность равна 0,190—0,200.
Приготовление взвеси лейкоцитов. В пробирку в качестве стабилизатора берут 1 мл 5% раствора секвестрена и 1 мл 10% раствора желатина для ускорения осаждения эритроцитов, а затем из вены — около 10 мл крови. Кровь тщательно перемешивают и оставляют отстаиваться на 40—50 мин. За это время осаждается большая часть эритроцитов. Снимают верхний мутный надетой, содержащий основную массу лейкоцитов с небольшой примесью эритроцитов и тромбоцитов. Надетой центрифугируют при 400—500 об/мин. в течение 7—8 мин. для осаждения лейкоцитов и оставшейся части эритроцитов. Плазму с добавленными секвестреном и желатином выбрасывают. Осадок взбалтывают в течение 1,5—2 мин. с 5 мл 0,3% раствора NaCl для разрушения оставшихся эритроцитов и немедленно доводят до изотонии 0,6 мл 5% раствора NaCl. Смесь вновь центрифугируют при вышеописанных условиях. Мутный розового цвета надетой (за счет гемолизированных эритроцитов) снимают и выливают. Под микроскопом проверяют наличие неразрушенных эритроцитов. Вышеописанную процедуру повторяют до тех пор, пока под микроскопом не останутся единичные в поле зрения неразрушенные эритроциты. Обычно это достигается после проведения данной процедуры 2—3 раза. Оставшиеся лейкоциты размешивают в 4 мл физиологического раствора NaCl и производят подсчет их в камере Горяева. Для получения устойчивых результатов достаточно 500—1000 лейкоцитов в 1 мм3.
Для определения щелочной фосфатазы лейкоцитов их необходимо предварительно разрушить. Это достигается двумя путями: либо добавлением к суспензии лейкоцитов 0,08—0,1 г очищенного сапонина, который не изменяет цвета суспензии, либо замораживанием суспензии в жидком азоте с последующим постепенным оттаиванием ее. Мы применяли в основном второй путь. Оценка степени разрушения лейкоцитов, проводившаяся под микроскопом, показала, что практически все лейкоциты бывают разрушены при применении обоих методов. Однако последний метод позволяет длительно хранить суспензии в замороженном виде, что дает возможность проводить инкубацию сразу нескольких образцов крови по мере накопления их в течение 3—4 дней.
Ход определения. В пробирку с 4 мл оттаянных и разрушенных лейкоцитов добавляют 2 мл забуференного субстрата (½ объема суспензии лейкоцитов) и 3—4 капли 0,3% раствора хлористого магния. Смесь ставят в водную баню или ультратермостат при 37° С на 1 час для инкубации. После инкубации пробы фильтруют и определяют их оптическую плотность па спектрофотометре СФ-4 при длине волны 400 ммк в кювете с рабочей толщиной слоя в 1 см при ширине щели 0,02 мм.
Зная, что оптическая плотность при 400 ммк 0,4 мг% раствора р-нитрофенола равняется 0,525, вычисляют количество образовавшихся в течение 1 часа миллимолей р-нитрофенола на 1010 лейкоцитарных клеток по следующей формуле:
Количество миллимолей р-нитрофенола = Еп x0.004x6x1010 / 0,525x139xЛ
где Еn — оптическая плотность испытуемой пробы; 0,004 — количество мг р-нитрофепола в 1 мл стандартного раствора; 6 — количество мл испытуемой пробы; 1010 — пересчет на 1010 лейкоцитов; 0,525 — оптическая плотность стандартного раствора р-нитрофенола, содержащего 0,004 мг его в 1 мл 139 — молекулярный вес р-нитрофепола; Л—количество лейкоцитов в испытуемой пробе.
Пример расчета. Взята взвесь лейкоцитов, в 1 мм3 которой содержится 650 лейкоцитов. Тогда в 4000 мм'3 (количество суспензии) содержится 2,5—106 лейкоцитов. После соответствующей обработки и инкубации взвеси лейкоцитов с добавленным субстратом в течение 1 часа при 37° в ультратермостате получаем оптическую плотность, равную 0,38, и активность щелочной фосфатазы выразится:
0,38х0.004х6х1010 / 0,525x139x2,5x10 6 мМ
(миллимолей) = 0.5 мМ р-нитрофенола на 1010 лейкоцитов.
Полученные результаты (предварительные). У 10 доноров количество щелочной фосфатазы колебалось от 0,3 до 0,55 мМ освобожденного р-нитрофенола.
У всех больных с хроническим миелолейкозом уровень активности щелочной фосфатазы был резко снижен и не превышал 0,2 мМ (колебания от 0,035 до 0,2 мМ). Напротив, у больных с миелофиброзом в подавляющем большинстве случаев он был повышен в 2 и более раз (от 0,8 до 3 мМ). Пока рано делать какие-либо определенные выводы, так как материал еще статистически не обработан.
About the authors
A. I. Buhin
Central Order of Lenin Institute of Hematology and Blood Transfusion
Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation
G. V. Derviz
Central Order of Lenin Institute of Hematology and Blood Transfusion
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation