Определение активности щелочной фосфатазы лейкоцитов

Аннотация

Определение активности щелочной фосфатазы лейкоцитов представляет интерес для целей практической и теоретической медицины. При ряде заболеваний (острые воспалительные заболевания, сепсис, лейкозы, злокачественные опухоли, лучевые по­ражения и др.) активность щелочной фосфатазы лейкоцитов часто закономерно ме­няется, что может послужить для дифференциальной диагностики и прогноза.

Полный текст

Большинство исследований щелочной фосфатазы лейкоцитов базируется на при­менении в различных модификациях качественных цитохимических методов, хотя и удобных (легкость взятия, обработки и хранения мазка крови), но все же довольно субъективных.

Из биохимических количественных методик, преимуществом которых является воз­можность точного количественного учета полученных результатов, следует упомянуть мо­дификации методик Боданского и Кея с применением в качестве субстрата ß-глицерофосфата натрия с последующим определением освободившегося фосфора. Мы пользовались методикой, разработанной Г. К. Шлыгиным и С. Я. Михлиным для определения щелочной фосфатазы в плазме крови. При этой методике применя­ется в качестве субстрата довольно доступный паранитрофенилфосфат натрия, и в ре­зультате воздействия фосфатазы на субстрат получается окрашенное вещество (па­ранитрофенол). Реакция идет в присутствии ионов Mg, которые являются активато­рами щелочной фосфатазы. Получающийся в результате реакции паранитрофенол в щелочных растворах имеет желтую окраску. По интенсивности окраски судят о ко­личестве освобожденного паранитрофенола, а отсюда — и об активности фермента, содержащегося в имеющемся количестве лейкоцитов. Для унификации результатов и возможности их сравнения с данными, полученными при других методах, мы предла­гаем количество освобожденного паранитрофенола выражать в миллимолях и пере­считывать на І0¹⁰ лейкоцитов. Реактивы, р-йи грофенилфосфат натрия или бария; 0,001 и. раствор НС1; водона­сыщенный бутиловый спирт; водонасыщенный этиловый эфир; аммиачная буферная смесь: 1 н. раствор NH3, проверенный титрометрически, смешивают с 1 н. раствором NH4CI в соотношении 4 : 1 (pH—10,1); 0,3% раствор MgCl₂; 5% раствор NaCl; 0,9% раствор NaCl; 0,3% раствор NaCl; 5% раствор секвестрена (динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты — ЭДТА-Na), готовится на горячем физиологическом растворе; 10% раствор желатины; р-нитрофенол для приготовления стандартных рас­творов; 0,1 н. раствор двузамещеиной соды (удобно брать безводный На₂СОз).

Приготовление забуференного раствора субстрата. Приготовляют 0,45% раствор р-нитрофенилфосфата натрия в 0,001 н. соляной кислоте. Раствор хранится 3—6 дней, его следует готовить столько, чтобы израсходовать за это время. Полученный раствор желтого цвета (примесь р-нитрофенола) взбалтывают (для  обесцвечивания) в дели­тельной воронке с равным количеством водонасыщенного бутилового спирта. Разде­лив оба слоя, образовавшиеся в делительной воронке, водный слой обрабатывают еще 1—2 раза бутиловым спиртом, а затем 1—2 раза эфиром. Бутиловый и эфирный слои выливают. В результате такой обработки водный раствор р-нитрэфенилфосфата ста­новится бесцветным. К полученному бесцветному раствору субстрата добавляют рас­твор аммиачного буфера из расчета 1 мл на каждые 9 мл субстрата (в смеси концен­трация буфера равна 0,1 н., а концентрация субстрата 0,4%). Забуференный суб­страт хранят в тщательно закрытом пробкой темном сосуде в холодильнике при 4° С. Если раствор при хранении окрашивается в желтый цвет, то он не годен и его за­меняют свежим.

Если применяется р-нитрофенилфосфат бария, то в этом случае приготовляют 0,9% раствор препарата в 0,001 н. растворе НС1 (примеси в препарате составляют около 50%). Навеску берут из расчета 0,9 г препарата на 100 мл НС1 с тем, чтобы общее количество раствора соответствовало 3—6-дневной потребности. Полученный мутный раствор фильтруют, фильтрат переносят в делительную виронку и дальнейшие процедуры производят так же, как и при приготовлении забуференного субстрата р-нитрофенилфосфата натрия. Небольшой осадок, образующийся после добавления аммиачной буферной смеси, удаляют фильтрованием.

Приготовление стандартного щелочного раствора р-нитрофенола. Приготовляют 0,4 л/г% раствор р-нитрофенола в 0,1 н-растворе Na₂COs. Удобно сначала пригото­вить этот раствор более концентрированным, взяв навеску 100 мг р-нитрофенола и растворив ее в 100 мл 0,1 н. раствора Nа₂СОз (100 мг% раствор). Раствор должен сто­ять ночь или более, и затем часть его разводят в 250 раз 0,1 н. раствором соды.

Степень окрашивания стандартного' раствора после его приготовления проверяют на спектрофотометре СФ-4; оптическая плотность должна быть равна 0,520—0,530 в области 400 ммк при толщине слоя в 1 см и ширине щели 0,02 мм (в нашем случае она равнялась 0,525). Можно воспользоваться для этой же цели и фотоэлектрическим колориметром (модель ФЭК-М, 1953 г.). При измерении с синим светофильтром в кю­вете на 5 см светового пути оптическая плотность равна 0,190—0,200.

Приготовление взвеси лейкоцитов. В пробирку в качестве стабилизатора берут 1 мл 5% раствора секвестрена и 1 мл 10% раствора желатина для ускорения осажде­ния эритроцитов, а затем из вены — около 10 мл крови. Кровь тщательно перемеши­вают и оставляют отстаиваться на 40—50 мин. За это время осаждается большая часть эритроцитов. Снимают верхний мутный надетой, содержащий основную массу лей­коцитов с небольшой примесью эритроцитов и тромбоцитов. Надетой центрифугируют при 400—500 об/мин. в течение 7—8 мин. для осаждения лейкоцитов и оставшейся части эритроцитов. Плазму с добавленными секвестреном и желатином выбрасывают. Осадок взбалтывают в течение 1,5—2 мин. с 5 мл 0,3% раствора NaCl для разруше­ния оставшихся эритроцитов и немедленно доводят до изотонии 0,6 мл 5% раствора NaCl. Смесь вновь центрифугируют при вышеописанных условиях. Мутный розового цвета надетой (за счет гемолизированных эритроцитов) снимают и выливают. Под микроскопом проверяют наличие неразрушенных эритроцитов. Вышеописанную про­цедуру повторяют до тех пор, пока под микроскопом не останутся единичные в по­ле зрения неразрушенные эритроциты. Обычно это достигается после проведения дан­ной процедуры 2—3 раза. Оставшиеся лейкоциты размешивают в 4 мл физиологическо­го раствора NaCl и производят подсчет их в камере Горяева. Для получения устой­чивых результатов достаточно 500—1000 лейкоцитов в 1 мм³.

Для определения щелочной фосфатазы лейкоцитов их необходимо предваритель­но разрушить. Это достигается двумя путями: либо добавлением к суспензии лейко­цитов 0,08—0,1 г очищенного сапонина, который не изменяет цвета суспензии, либо замораживанием суспензии в жидком азоте с последующим постепенным оттаиванием ее. Мы применяли в основном второй путь. Оценка степени разрушения лейкоцитов, проводившаяся под микроскопом, показала, что практически все лейкоциты бывают разрушены при применении обоих методов. Однако последний метод позволяет дли­тельно хранить суспензии в замороженном виде, что дает возможность проводить ин­кубацию сразу нескольких образцов крови по мере накопления их в течение 3—4 дней.

Ход определения. В пробирку с 4 мл оттаянных и разрушенных лейкоцитов до­бавляют 2 мл забуференного субстрата (½ объема суспензии лейкоцитов) и 3—4 кап­ли 0,3% раствора хлористого магния. Смесь ставят в водную баню или ультратермостат при 37° С на 1 час для инкубации. После инкубации пробы фильтруют и опре­деляют их оптическую плотность па спектрофотометре СФ-4 при длине волны 400 ммк в кювете с рабочей толщиной слоя в 1 см при ширине щели 0,02 мм.

Зная, что оптическая плотность при 400 ммк 0,4 мг% раствора р-нитрофенола рав­няется 0,525, вычисляют количество образовавшихся в течение 1 часа миллимолей р-нитрофенола на 10¹⁰ лейкоцитарных клеток по следующей формуле:

Количество миллимолей р-нитрофенола =  ^{Еп x0.004x6x1010} / _0,525x139xЛ  

где Еn — оптическая плотность испытуемой пробы; 0,004 — количество мг р-нитрофепола в 1 мл стандартного раствора; 6 — количество мл испытуемой пробы; 10¹⁰ — пе­ресчет на 10¹⁰ лейкоцитов; 0,525 — оптическая плотность стандартного раствора р-нитрофенола, содержащего 0,004 мг его в 1 мл 139 — молекулярный вес р-нитрофепола; Л—количество лейкоцитов в испытуемой пробе.

Пример расчета. Взята взвесь лейкоцитов, в 1 мм³ которой содержится 650 лейко­цитов. Тогда в 4000 мм'³ (количество суспензии) содержится 2,5—10⁶ лейкоцитов. Пос­ле соответствующей обработки и инкубации взвеси лейкоцитов с добавленным суб­стратом в течение 1 часа при 37° в ультратермостате получаем оптическую плотность, равную 0,38, и активность щелочной фосфатазы выразится:   

^{0,38х0.004х6х1010} / _{0,525x139x2,5x10 ⁶ мМ}

(миллимолей) = 0.5 мМ р-нитрофенола на 10¹⁰ лейкоцитов.

Полученные результаты (предварительные). У 10 доноров количество щелочной фосфатазы колебалось от 0,3 до 0,55 мМ освобожденного р-нитрофенола.

У всех больных с хроническим миелолейкозом уровень активности щелочной фос­фатазы был резко снижен и не превышал 0,2 мМ (колебания от 0,035 до 0,2 мМ). Напротив, у больных с миелофиброзом в подавляющем большинстве случаев он был повышен в 2 и более раз (от 0,8 до 3 мМ). Пока рано делать какие-либо определен­ные выводы, так как материал еще статистически не обработан.