Determination of the activity of alkaline phosphatase of leukocytes

Abstract

Determination of the activity of alkaline phosphatase of leukocytes is of interest for the purposes of practical and theoretical medicine. In a number of diseases (acute inflammatory diseases, sepsis, leukemias, malignant tumors, radiation injuries, etc.), the activity of alkaline phosphatase of leukocytes often changes naturally, which can serve for differential diagnosis and prognosis.

Full Text

Определение активности щелочной фосфатазы лейкоцитов представляет интерес для целей практической и теоретической медицины. При ряде заболеваний (острые воспалительные заболевания, сепсис, лейкозы, злокачественные опухоли, лучевые по­ражения и др.) активность щелочной фосфатазы лейкоцитов часто закономерно ме­няется, что может послужить для дифференциальной диагностики и прогноза.

Большинство исследований щелочной фосфатазы лейкоцитов базируется на при­менении в различных модификациях качественных цитохимических методов, хотя и удобных (легкость взятия, обработки и хранения мазка крови), но все же довольно субъективных.

Из биохимических количественных методик, преимуществом которых является воз­можность точного количественного учета полученных результатов, следует упомянуть мо­дификации методик Боданского и Кея с применением в качестве субстрата ß-глицерофосфата натрия с последующим определением освободившегося фосфора. Мы пользовались методикой, разработанной Г. К. Шлыгиным и С. Я. Михлиным для определения щелочной фосфатазы в плазме крови. При этой методике применя­ется в качестве субстрата довольно доступный паранитрофенилфосфат натрия, и в ре­зультате воздействия фосфатазы на субстрат получается окрашенное вещество (па­ранитрофенол). Реакция идет в присутствии ионов Mg, которые являются активато­рами щелочной фосфатазы. Получающийся в результате реакции паранитрофенол в щелочных растворах имеет желтую окраску. По интенсивности окраски судят о ко­личестве освобожденного паранитрофенола, а отсюда — и об активности фермента, содержащегося в имеющемся количестве лейкоцитов. Для унификации результатов и возможности их сравнения с данными, полученными при других методах, мы предла­гаем количество освобожденного паранитрофенола выражать в миллимолях и пере­считывать на І0¹⁰ лейкоцитов. Реактивы, р-йи грофенилфосфат натрия или бария; 0,001 и. раствор НС1; водона­сыщенный бутиловый спирт; водонасыщенный этиловый эфир; аммиачная буферная смесь: 1 н. раствор NH3, проверенный титрометрически, смешивают с 1 н. раствором NH4CI в соотношении 4 : 1 (pH—10,1); 0,3% раствор MgCl₂; 5% раствор NaCl; 0,9% раствор NaCl; 0,3% раствор NaCl; 5% раствор секвестрена (динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты — ЭДТА-Na), готовится на горячем физиологическом растворе; 10% раствор желатины; р-нитрофенол для приготовления стандартных рас­творов; 0,1 н. раствор двузамещеиной соды (удобно брать безводный На₂СОз).

Приготовление забуференного раствора субстрата. Приготовляют 0,45% раствор р-нитрофенилфосфата натрия в 0,001 н. соляной кислоте. Раствор хранится 3—6 дней, его следует готовить столько, чтобы израсходовать за это время. Полученный раствор желтого цвета (примесь р-нитрофенола) взбалтывают (для  обесцвечивания) в дели­тельной воронке с равным количеством водонасыщенного бутилового спирта. Разде­лив оба слоя, образовавшиеся в делительной воронке, водный слой обрабатывают еще 1—2 раза бутиловым спиртом, а затем 1—2 раза эфиром. Бутиловый и эфирный слои выливают. В результате такой обработки водный раствор р-нитрэфенилфосфата ста­новится бесцветным. К полученному бесцветному раствору субстрата добавляют рас­твор аммиачного буфера из расчета 1 мл на каждые 9 мл субстрата (в смеси концен­трация буфера равна 0,1 н., а концентрация субстрата 0,4%). Забуференный суб­страт хранят в тщательно закрытом пробкой темном сосуде в холодильнике при 4° С. Если раствор при хранении окрашивается в желтый цвет, то он не годен и его за­меняют свежим.

Если применяется р-нитрофенилфосфат бария, то в этом случае приготовляют 0,9% раствор препарата в 0,001 н. растворе НС1 (примеси в препарате составляют около 50%). Навеску берут из расчета 0,9 г препарата на 100 мл НС1 с тем, чтобы общее количество раствора соответствовало 3—6-дневной потребности. Полученный мутный раствор фильтруют, фильтрат переносят в делительную виронку и дальнейшие процедуры производят так же, как и при приготовлении забуференного субстрата р-нитрофенилфосфата натрия. Небольшой осадок, образующийся после добавления аммиачной буферной смеси, удаляют фильтрованием.

Приготовление стандартного щелочного раствора р-нитрофенола. Приготовляют 0,4 л/г% раствор р-нитрофенола в 0,1 н-растворе Na₂COs. Удобно сначала пригото­вить этот раствор более концентрированным, взяв навеску 100 мг р-нитрофенола и растворив ее в 100 мл 0,1 н. раствора Nа₂СОз (100 мг% раствор). Раствор должен сто­ять ночь или более, и затем часть его разводят в 250 раз 0,1 н. раствором соды.

Степень окрашивания стандартного' раствора после его приготовления проверяют на спектрофотометре СФ-4; оптическая плотность должна быть равна 0,520—0,530 в области 400 ммк при толщине слоя в 1 см и ширине щели 0,02 мм (в нашем случае она равнялась 0,525). Можно воспользоваться для этой же цели и фотоэлектрическим колориметром (модель ФЭК-М, 1953 г.). При измерении с синим светофильтром в кю­вете на 5 см светового пути оптическая плотность равна 0,190—0,200.

Приготовление взвеси лейкоцитов. В пробирку в качестве стабилизатора берут 1 мл 5% раствора секвестрена и 1 мл 10% раствора желатина для ускорения осажде­ния эритроцитов, а затем из вены — около 10 мл крови. Кровь тщательно перемеши­вают и оставляют отстаиваться на 40—50 мин. За это время осаждается большая часть эритроцитов. Снимают верхний мутный надетой, содержащий основную массу лей­коцитов с небольшой примесью эритроцитов и тромбоцитов. Надетой центрифугируют при 400—500 об/мин. в течение 7—8 мин. для осаждения лейкоцитов и оставшейся части эритроцитов. Плазму с добавленными секвестреном и желатином выбрасывают. Осадок взбалтывают в течение 1,5—2 мин. с 5 мл 0,3% раствора NaCl для разруше­ния оставшихся эритроцитов и немедленно доводят до изотонии 0,6 мл 5% раствора NaCl. Смесь вновь центрифугируют при вышеописанных условиях. Мутный розового цвета надетой (за счет гемолизированных эритроцитов) снимают и выливают. Под микроскопом проверяют наличие неразрушенных эритроцитов. Вышеописанную про­цедуру повторяют до тех пор, пока под микроскопом не останутся единичные в по­ле зрения неразрушенные эритроциты. Обычно это достигается после проведения дан­ной процедуры 2—3 раза. Оставшиеся лейкоциты размешивают в 4 мл физиологическо­го раствора NaCl и производят подсчет их в камере Горяева. Для получения устой­чивых результатов достаточно 500—1000 лейкоцитов в 1 мм³.

Для определения щелочной фосфатазы лейкоцитов их необходимо предваритель­но разрушить. Это достигается двумя путями: либо добавлением к суспензии лейко­цитов 0,08—0,1 г очищенного сапонина, который не изменяет цвета суспензии, либо замораживанием суспензии в жидком азоте с последующим постепенным оттаиванием ее. Мы применяли в основном второй путь. Оценка степени разрушения лейкоцитов, проводившаяся под микроскопом, показала, что практически все лейкоциты бывают разрушены при применении обоих методов. Однако последний метод позволяет дли­тельно хранить суспензии в замороженном виде, что дает возможность проводить ин­кубацию сразу нескольких образцов крови по мере накопления их в течение 3—4 дней.

Ход определения. В пробирку с 4 мл оттаянных и разрушенных лейкоцитов до­бавляют 2 мл забуференного субстрата (½ объема суспензии лейкоцитов) и 3—4 кап­ли 0,3% раствора хлористого магния. Смесь ставят в водную баню или ультратермостат при 37° С на 1 час для инкубации. После инкубации пробы фильтруют и опре­деляют их оптическую плотность па спектрофотометре СФ-4 при длине волны 400 ммк в кювете с рабочей толщиной слоя в 1 см при ширине щели 0,02 мм.

Зная, что оптическая плотность при 400 ммк 0,4 мг% раствора р-нитрофенола рав­няется 0,525, вычисляют количество образовавшихся в течение 1 часа миллимолей р-нитрофенола на 10¹⁰ лейкоцитарных клеток по следующей формуле:

Количество миллимолей р-нитрофенола =  ^{Еп x0.004x6x1010} / _0,525x139xЛ  

где Еn — оптическая плотность испытуемой пробы; 0,004 — количество мг р-нитрофепола в 1 мл стандартного раствора; 6 — количество мл испытуемой пробы; 10¹⁰ — пе­ресчет на 10¹⁰ лейкоцитов; 0,525 — оптическая плотность стандартного раствора р-нитрофенола, содержащего 0,004 мг его в 1 мл 139 — молекулярный вес р-нитрофепола; Л—количество лейкоцитов в испытуемой пробе.

Пример расчета. Взята взвесь лейкоцитов, в 1 мм³ которой содержится 650 лейко­цитов. Тогда в 4000 мм'³ (количество суспензии) содержится 2,5—10⁶ лейкоцитов. Пос­ле соответствующей обработки и инкубации взвеси лейкоцитов с добавленным суб­стратом в течение 1 часа при 37° в ультратермостате получаем оптическую плотность, равную 0,38, и активность щелочной фосфатазы выразится:   

^{0,38х0.004х6х1010} / _{0,525x139x2,5x10 ⁶ мМ}

(миллимолей) = 0.5 мМ р-нитрофенола на 10¹⁰ лейкоцитов.

Полученные результаты (предварительные). У 10 доноров количество щелочной фосфатазы колебалось от 0,3 до 0,55 мМ освобожденного р-нитрофенола.

У всех больных с хроническим миелолейкозом уровень активности щелочной фос­фатазы был резко снижен и не превышал 0,2 мМ (колебания от 0,035 до 0,2 мМ). Напротив, у больных с миелофиброзом в подавляющем большинстве случаев он был повышен в 2 и более раз (от 0,8 до 3 мМ). Пока рано делать какие-либо определен­ные выводы, так как материал еще статистически не обработан.