Morphofunctional state of platelets in their concentrates depending on storage time

Full Text

Актуальность

Концентраты тромбоцитов играют важную роль в трансфузионной медицине как гемостатическое средство, причём за последнее десятилетие спрос на концентраты тромбоцитов увеличился как в России, так и во всём мире [1, 2]. Возросшая потребность в концентратах тромбоцитов в значительной степени связана с увеличением частоты онкогематологических заболеваний, осложняющихся геморрагическим синдромом и требующих частых трансфузий тромбоцитарной массы [1].

К сожалению, наряду с лечебной эффективностью, при переливании тромбоцитов есть риск посттрансфузионных реакций, связанных с повреждением тромбоцитов при хранении и бактериальным заражением [3]. В связи с этим необходимость изучения сохранности тромбоцитов в процессе их заготовки и хранения имеет возрастающее значение. На качество тромбоцитарных концентратов могут влиять различные факторы: методы получения, особенности различных фракционных аппаратов, добавочных растворов, материалов для хранения, использование различных технологий инактивации патогенов и нейтрализации донорских лейкоцитов, температура хранения и др. Все эти воздействия могут приводить к выраженным изменениям функциональных и морфологических характеристик тромбоцитов и, в конечном счёте, — к различной эффективности и безопасности тромбоцитарных концентратов [3–5].

Тромбоциты — безъядерные форменные элементы крови, которые образуются из мегакариоцитов и циркулируют в кровотоке 7–10 сут, после чего подвергаются элиминации и разрушению в селезёнке. В крови взрослого человека в норме от 150×10⁹/л до 400×10⁹/л тромбоцитов. Они играют ключевую роль в реакциях гемостаза благодаря их адгезии к субэндотелиальным структурам в участке повреждения сосуда, образованию агрегатов, секреции биоактивных веществ и прокоагулянтной активности клеточной мембраны, на которой собираются активные комплексы факторов свёртывания крови [6]. В последнее время к важным гемостатическим свойствам тромбоцитов относят их способность вызывать сжатие (ретракцию, или контракцию) сгустков крови [7].

Патология тромбоцитов часто проявляется уменьшением количества тромбоцитов в крови (тромбоцитопенией — уровень тромбоцитов в крови ≤100×10⁹/л) и/или их качественными дефектами (тромбоцитопатией) и, как правило, сопровождается риском кровоточивости [8]. Госпитализация необходима при уровне тромбоцитов ниже 20×109/л, переливание концентратов тромбоцитов (тромбомассы) обычно назначают при содержании тромбоцитов ниже 10×10⁹/л, а при кровотечении — ниже 50×10⁹/л [9].

Аутологичный концентрат тромбоцитов может быть использован в сердечно-сосудистой хирургии при операциях, которые часто осложняются тромбоцитопенией [10]. Аллогенные концентраты тромбоцитов применяют в гематологии, онкологии и хирургии, а также в других областях медицины [11].

Эффективность применения концентратов тромбоцитов для профилактики и лечения кровотечений зависит от методов их получения, сроков и условий хранения [12]. Есть два основных способа получения донорских тромбоцитов: метод цитафереза c использованием специальных сепараторов крови и центрифугирование стабилизированной цельной крови. Последний способ подразделяется на выделение тромбоцитов из надосадочной жидкости, то есть обогащённой тромбоцитами плазмы, или из лейкотромбослоя, который образуется при центрифугировании крови между осадком эритроцитов и плазмой [10].

Изолированные тромбоциты суспендируют или в нативной плазме крови, или в плазме, разбавленной солевым раствором, до концентрации клеток не менее 1–2×10⁶/мкл [13]. После приготовления концентраты тромбоцитов, как правило, хранят при температуре 20–24 °C при постоянном покачивании в ёмкостях из специального материала, который обеспечивает газообмен с атмосферой [12–15].

Концентраты тромбоцитов должны отвечать следующим требованиям: не иметь видимых агрегатов, водородный показатель (рН) не менее 6,4, содержание тромбоцитов не менее 1–2×106/мкл, целостность контейнера для хранения не должна быть нарушена. Срок годности концентратов тромбоцитов варьирует от 3 до 7 дней [10]. Комплексная оценка функционального состояния тромбоцитов в составе концентратов может помочь усовершенствовать методику их получения, условия и сроки хранения, увеличить их профилактическую и лечебную эффективность, а также снизить риск побочных эффектов трансфузии.

Цель

Цель данного исследования — комплексное изу­чение динамики морфофункционального состояния тромбоцитов в процессе хранения на сроках до 7 дней. Исследование включало оценку экспрессии молекулярных маркёров активации тромбоцитов (Р-селектина, фосфатидилсерина, активного интегрина αIIbβ3), метаболической активности [митохондриальный потенциал, уровень внутриклеточного аденозинтрифосфата (АТФ)], контрактильных свойств тромбоцитов, способности к агрегации, а также морфологических и морфометрических характеристик.

Материал и методы исследования

Получение и общая характеристика концентратов тромбоцитов. Всего исследовано 202 образца концентратов, полученных методом афереза из крови доноров старше 18 лет, давших письменное согласие на взятие крови и прошедших предварительное медицинское обследование в соответствии с приказом Мин­здрава России №1166н от 28 октября 2020 г. «Об утверждении порядка прохождения донорами медицинского обследования и перечня медицинских противопоказаний (временных и постоянных) для сдачи крови и (или) её компонентов и сроков отвода, которому подлежит лицо при наличии временных медицинских показаний, от донорства крови и (или) её компонентов» [16].

Концентраты тромбоцитов получали в отделении заготовки крови и её компонентов Меж­регионального клинико-диагностического центра г. Казани, используя сепаратор клеток крови Trima Accel (Caridian BCT, США), в соответствии c инструкцией производителя.

Концентраты тромбоцитов хранили до 7 дней при температуре 20–24 °С в добавочном растворе SSP+ (Macopharma, Франция) в соответствии с нормативными документами [13]. Конечный объём концентрата тромбоцитов составлял не более 200 мл с концентрацией не менее 10⁶/мкл.

Получение бестромбоцитной плазмы. Бес­тромбоцитная плазма была получена путём центрифугирования цитратной крови при 200 g 10 мин с последующим отбором надосадка, содержащего тромбоциты, и его повторным осаждением при 10 000 g 10 мин. Бестромбоцитную плазму использовали для суспендирования концентратов тромбоцитов и изучения их агрегационной и контрактильной активности.

Проточная цитометрия тромбоцитов. Для оценки функционального состояния и реактивности тромбоцитов определяли фоновую и индуцированную экспрессию P-селектина (CD62p) и активного интегрина αIIbβ3 методом проточной цитометрии. Исследование проводили до и после активации тромбоцитов под действием гексапептида TRAP-6. Кроме того, определяли экспрессию фосфатидилсеринов до и после активации тромбоцитов кальциевым ионофором А23187, а также трансмембранный потенциал митохондрий в покоящихся тром­боцитах.

Для оценки экспрессии Р-селектина к образцам добавляли моноклональные антитела против CD62p, меченые фикоэритрином (BD Biosciences, США). Для анализа экспрессии активного интегрина αIIbβ3 к образцам добавляли антитела PAC-1, меченые флюоресцеин-5-изотиоцианатом (BD Biosciences, США).

Для оценки экспрессии фосфатидилсеринов к образцам тромбоцитов добавляли аннексин V, меченый флюоресцеин-5-изотиоцианатом (Abcam, США).

Измерение митохондриального потенциала тромбоцитов (ΔΨm) проводили с помощью ΔΨm-чувствительного флюоресцентного красителя Mitotracker Deep Red (Invitrogen, США).

Измерения выполняли на проточном цитометре FACS Calibur, оснащённом программой BD CellQuest™ (BD Biosciences, США). Анализ сигналов проводили с помощью программы FlowJo VX.

Агрегация тромбоцитов. Агрегацию тромбоцитов оценивали с помощью оптического агрегометра Biola 220LA (Россия). В качестве индукторов агрегации использовали коллаген (Технология Стандарт, Россия) и активирующий пептид TRAP-6 (Sigma-Aldrich, США).

Сократительная (контрактильная) функция тромбоцитов. Сократительную активность тромбоцитов изучали с помощью оптического прибора «Регистратор тромбодинамики» (ООО «ГемаКор», Россия). Образцы концентратов тромбоцитов разводили объединённой бестромбоцитной плазмой до концентрации 5×105/мкл, после чего добавляли хлорид кальция и тромбин (Sigma-Aldrich, США). Активированную смесь плазмы и тромбоцитов переносили в измерительную кювету для свёртывания и последующей контракции сгустка. Размер сгустка фиксировали цифровой фотокамерой в рассеянном свете каждые 15 с в течение 20 мин при 37 °С. По серийным изображениям строили кинетическую кривую контракции сгустка и определяли степень контракции.

Определение внутриклеточного АТФ в концентратах тромбоцитов. Лизаты тромбоцитов центрифугировали при 2000 g в течение 10 мин для удаления клеточного дебриса. Концентрацию АТФ в супернатанте лизатов измеряли с использованием коммерческого набора для биолюминесцентного анализа (Sigma-Aldrich, США) на планшетном фотометре Infiniti 200 PRO (Tecan, Швейцария). Концентрацию АТФ нормализовали по содержанию белка, которое определяли с помощью набора Pierce BCA Protein Assay Kit (ThermoFisher Scientific, США).

Сканирующая электронная микроскопия тромбоцитов. Образцы концентратов тромбоцитов фиксировали глутаровым альдегидом и осаждали центрифугированием на поликарбонатном фильтре с размером пор 0,4 мкм, промывали какодилатным буфером, обезвоживали этанолом в восходящих концентрациях, инкубировали с гексаметилдисилазаном и высушивали. Образцы покрывали золотом и палладием с последующей визуализацией на сканирующем электронном микроскопе Quanta 250FEG (FEI, США).

Статистический анализ. Статистический анализ выполняли с использованием программного пакета GraphPad Prism 8.0.1. После оценки нормальности данных для многофакторного анализа непараметрических данных применяли критерий Краскела–Уоллиса с последующим попарным сравнением тестом Данна. Для множественных параметрических данных использовали односторонний дисперсионный анализ (ANOVA-тест), с последующим тестом Тьюки для парных сравнений. Уровень статистической значимости 95% (p <0,05).

Результаты

Экспрессия P-cелектина как маркёра секреторной активности тромбоцитов. Для оценки функционального состояния тромбоцитов в концентратах на разных сроках хранения исследовали спонтанную и индуцированную экспрессию P-селектина (CD62p) (рис. 1, А). ­Наличие этого белка на поверхности тромбоцитов (определяемое по связыванию меченых моноклональных анти-CD62p антител) указывает на секрецию содержимого α-гранул, которая сопровождает активацию тромбоцитов [6].

На рис. 1, А показано, что спонтанная экспрессия P-селектина в покоящихся тромбоцитах возрастала в процессе хранения без всякого внешнего воздействия. Если в день получения концентратов медианная доля тромбоцитов, экспрессирующих P-селектин, составляла 7% (IQR 5–14%), то на 2–3-й дни хранения это значение возросло до 18% (IQR 10–34%, p=0,0001), а на 4–7-й показатель вырос до 51% (IQR 31–66%, p <0,0001 по сравнению с 1-м и 2–3-м днями). Эти результаты указывают на прогрессирующую спонтанную активацию тромбоцитов в процессе хранения концентратов.

Способность тромбоцитов отвечать на стимуляцию исследовали по уровню экспрессии P-селектина до и после воздействия пептида (TRAP), имитирующего действие тромбина на PAR1-рецепторы. Как видно на рис. 1, Б, по сравнению с покоящимися тромбоцитами TRAP вызывал повышенную секрецию P-селектина в тромбоцитах на всех сроках наблюдения. Индуцированная экспрессия Р-селектина была самой высокой в день получения концентрата тромбоцитов и составляла 95% (IQR 89–97%), затем достоверно снижалась на 2–3-й дни хранения (89%; IQR 84–94%, p=0,0041) и 4–7-й дни хранения (89%; IQR 83–94%, p=0,0025 по сравнению с днём заготовки концентратов). Таким образом, тромбоциты в концентратах сохраняли способность к активации в ответ на биохимический стимул, однако реактивность тромбоцитов снижалась со временем.

Экспрессия активного интегрина αIIbβ3 как интегрального маркёра функционального состояния тромбоцитов. Интегрин αIIbβ3 (CD41/CD61, GPIIb/IIIa) — адгезивный белок, который присутствует в плазматической мембране покоящихся тромбоцитов в неактивной форме. При активации тромбоцитов интегрин αIIbβ3 переходит в активное состояние, приобретая способность связываться с внеклеточными лигандами (фибриногеном, фибрином, фактором Виллебранда) и опосредовать адгезию и агрегацию тромбоцитов. Кроме того, при активации тромбоцитов происходит дополнительная секреция αIIbβ3 из α-гранул, следовательно, уровень активного интегрина αIIbβ3 на поверхности тромбоцитов служит важным интегральным показателем их функционального состояния. В данном исследовании экспрессию αIIbβ3 определяли методом проточной цитометрии по связыванию меченых моноклональных антител PAC-1, которые избирательно взаимодействуют с активной формой αIIbβ3.

На рис. 1 представлена спонтанная и TRAP-индуцированная экспрессия активного интегрина αIIbβ3 в тромбоцитах на разных сроках хранения концентратов тромбоцитов. Уровень экспрессии активного интегрина αIIbβ3 в покоящихся (неактивированных) тромбоцитах был низким и постоянным на всех изученных сроках хранения (изменения в динамике недостоверны, p=0,109; см. рис. 1, А). По сравнению с покоящимися тромбоцитами TRAP вызывал повышенную экспрессию ­активного αIIbβ3, ­которая прогрессивно снижалась в процессе хранения концентратов тромбоцитов (см. рис. 1, Б).

 

Рис. 1. Спонтанная (A) и индуцированная (Б) экспрессия маркёров активации в тромбоцитах на разных сроках хранения концентратов тромбоцитов. Число образцов в дни исследования составило для P-селектина n=33–49; для активного интегрина αIIbβ3 n=23–36; для фосфатидилсерина n=25–37. Результаты представлены как медиана и интер­квартильный интервал; ***p <0,0001, **p <0,001; *p <0,05; тест Краскела–Уоллиса с последующим тестом Данна для парных сравнений

 

Если в день получения концентратов медианная доля активированных тромбоцитов, реагирующих с PAC-1, составляла 38% (IQR 25–55%), то на 2–3-й дни хранения она снижалась до 24% (IQR 17–44%, p=0,09), а на 4–7-й дни падала до 15% (IQR 9–28%, p <0,0001 по сравнению с 1-м днём и p=0,039 по сравнению с 2–3-м днями). Таким образом, как и по данным исследования P-селектина, тромбоциты в концентратах сохраняли способность отвечать на биохимическую стимуляцию экспрессией активированного интегрина, однако эта способность прогрессивно снижалась по мере хранения. Важно отметить, что к 4–7-му дням хранения уровень экспрессии активного αIIbβ3 в ответ на стимул снижался практически до уровня покоящихся (неактивированных) тромбоцитов, что указывает на их рефрактерность.

Агрегация тромбоцитов. Образование тромбоцитарных агрегатов в месте повреждения сосуда — важный компонент гемостаза. Агрегация тромбоцитов обусловлена тем, что в ответ на стимуляцию тромбоцитов химическими индукторами и включение внутриклеточных сигнальных систем молекулы интегрина αIIbβ3 на наружной мембране активируются и взаимодействуют с растворённым в плазме крови белком фибриногеном, который «склеивает» тромбоциты между собой [6]. In vitro агрегацию суспендированных тромбоцитов в ответ на стимуляцию можно регистрировать оптически по нарастанию светопропускания, а степень агрегации используют для характеристики функционального состояния тромбоцитов.

Агрегация тромбоцитов в концентратах, индуцированная коллагеном и TRAP, представлена на рис. 2. Степень агрегации в ответ на растворимый коллаген была наибольшей в день получения концентратов и составляла 57% (медиана, IQR 44–61%). На 2–3-й дни хранения медианные значения степени агрегации снижались до 22% (IQR 1–50%, p <0,002), а на 4–7-й дни хранения — до 0,5% (IQR 0,1–15%; p=0,04 по сравнению с 2–3-м днями и p <0,0001 по сравнению с днём получения). Таким образом, по мере хранения концентратов агрегационная активность тромбоцитов в ответ на коллаген прогрессивно снижалась вплоть до полного исчезновения агрегации во многих образцах.

 

Рис. 2. Степень агрегации тромбоцитов, индуцированной коллагеном (А) или пептидом TRAP-6 (Б), на разных сроках хранения концентратов тромбоцитов. При агрегации, вызванной коллагеном, число образцов в дни исследования составило n=19–29; при агрегации, вызванной TRAP, n=26–36. Результаты представлены как медиана и интерквартильный интервал; ***p <0,0001, **p <0,001, *p <0,05; тест Краскела–Уоллиса с последующим тестом Данна для парных сравнений

 

Тромбоциты, активированные пептидом TRAP, по сравнению с коллагеном имели значительно более стойкую способность к агрегации. В день получения концентратов медианная степень агрегации тромбоцитов составляла 53% (медиана, IQR 44–65%), причём на 2–3-й дни она практически не менялась (55%; IQR 29–60%; p=0,17). Степень агрегации тромбоцитов существенно снижалась до 36% (IQR 3–45%) только на 4–7-й дни (p <0,0001 по сравнению с днём заготовки концентратов и p=0,01 по сравнению с 2–3-м днями хранения).

Результаты показывают, что тромбоциты в свежеполученных концентратах способны к агрегации, индуцированной коллагеном и TRAP, однако степень агрегации прогрессивно уменьшалась по мере хранения. При этом способность тромбоцитов к агрегации, вызванной через тромбиновые PAR1-рецепторы, чувствительные к TRAP, была значительно более устойчивой к хранению, чем при активации тромбоцитов через коллагеновые рецепторы GPVI и α2β1.

Экспрессия фосфатидилсеринов как показатель прокоагулянтных свойств тромбоцитов. В покоящихся тромбоцитах фосфатидилсерины, как и большинство отрицательно заряженных фосфолипидов, находятся во внутреннем листке плазматической мембраны. В активированных тромбоцитах происходит экстернализация фосфатидилсеринов на поверхность плазматической мембраны, что придаёт ей прокоагулянтные свойства в качестве матрицы для сборки ферментных комплексов гемокоагуляции (внутренней теназы и протромбиназы) [6]. In vitro экспрессия фосфатидилсеринов, определяемая проточной цитометрией по способности связывать меченый белок аннексин V, может служить маркёром активации тромбоцитов и показателем их прокоагулянтной активности.

На рис. 1 представлена спонтанная и индуцированная экспрессия фосфатидилсеринов на поверхности тромбоцитов на разных сроках хранения концентратов тромбоцитов. В день получения концентратов медианная доля покоящихся (неактивированных) тромбоцитов, экспрессирующих фосфатидилсерины, составляла 6% (IQR 2–12%), на 2–3-й дни это значение не изменилось (5%; IQR 3–15%, p >0,9), а на 4–7-й дни уровень экспрессии фосфатидилсеринов возрос до 18% (IQR 12–34%; p <0,0001 по сравнению с 2–3-м днями хранения, а также по сравнению с днём заготовки концентратов) (см. рис. 1, А).

В качестве положительного контроля исследовали те же концентраты тромбоцитов после обработки кальциевым ионофором А23187, который является сильным индуктором поверхностной экспрессии фосфатидилсеринов. В ответ на действие ионофора происходит выраженная экстернализация фосфатидилсеринов, которая снижается по мере хранения концентратов тромбоцитов (см. рис. 1, Б). В день получения концентратов медианная доля тромбоцитов, экспрессирующих фосфатидилсерины в ответ на стимуляцию ионофором, была очень высокой (96%, IQR 95–98%) и сохранялась на 2–3-й дни хранения (96%, IQR 92–97%, p=0,6), после чего эта величина умеренно, но достоверно снижалась на 4–7-й дни хранения (92%, IQR 82–95%, p=0,0001 по сравнению с 1-м днём, p=0,005 по сравнению с 2–3-м днями).

Таким образом, исходный фоновый уровень активации и прокоагулянтной активности тромбоцитов в составе концентратов, по данным экспрессии фосфатидилсеринов, минимален, однако нарастает по мере хранения. Вместе с тем, на всех изученных сроках хранения тромбоциты в составе концентратов сохраняют высокий прокоагулянтный потенциал и способность экспрессировать фосфатидилсерины в ответ на стимуляцию, сопровождающуюся увеличением внутриклеточной концентрации Ca²⁺.

Контракция (ретракция) фибриновых сгустков как показатель сократительной функции тромбоцитов. Контракция, или ретракция, — процесс сжатия сгустка под действием активированных тромбоцитов, поэтому данное явление можно использовать как тест для характеристики их функционального состояния. В качестве показателя сократительной способности тромбоцитов использовали степень контракции сгустков, образованных добавлением тромбина к объединённой ­бестромбоцитной цитратной плазме крови, смешанной с концентратами тромбоцитов до одинаковой конечной концентрации клеток (5×105/мкл), близкой к физиологической.

По данным, представленным на рис. 3, в подавляющем большинстве образцов степень контракции сгустков на разных сроках хранения концентратов тромбоцитов менялась незначительно, без достоверных различий (p=0,2). Так, медианная степень контракции в день получения концентратов составляла 87% (IQR 85–89%), на 2–3-й дни — 87% (IQR 82–89%, p >0,9), а на 4–7-й дни — 82% (IQR 7–90%, p=0,3 по сравнению с днём получения, p=0,5 по сравнению с 2–3-м днём). Вместе с тем, в единичных образцах контрактильная функция тромбоцитов на более поздних сроках хранения падала до нуля (см. рис. 3), что указывает на наличие отдельных образцов концентратов тромбоцитов, менее устойчивых к хранению, чем их основная масса. Другие параметры кинетики контракции сгустков (лаг-период, площадь под кинетической кривой и средняя скорость образования сгустка) отражали ту же закономерность (данные не показаны).

 

Рис. 3. Сократительная функция тромбоцитов на разных сроках хранения концентратов тромбоцитов, определённая по способности вызывать сокращение (контракцию) сгустков в плазме крови. Число образцов в дни исследования составило n=12–36. Результаты представлены как медиана и интерквартильный интервал

 

При анализе оказалось, что в подгруппе концентратов тромбоцитов с наименьшей способностью к контракции (0–59%) был наиболее высокий фоновый уровень экспрессии Р-селектина (77%; IQR 60–83%), а в подгруппе с наибольшей степенью контракции (60–89%) — наоборот, низкий фоновый уровень экспрессии Р-селектина (11%; IQR 9–26%, р <0,0001), что указывает на выраженную спонтанную активацию и возможное вторичное истощение тромбоцитов в этих образцах.

Энергетический потенциал тромбоцитов. Трансмембранный потенциал митохондрий (ΔΨ_m) служит важным параметром энергетического потенциала клеток. Его величину оценивали методом проточной цитометрии по интенсивности флюоресценции ΔΨ_m-чувствительного маркёра. Как показано на рис. 4, А, митохондриальный потенциал тромбоцитов в концентратах был достаточно высоким и не менялся в процессе наблюдения (p=0,3): в день заготовки медианное значение составляло 282±65 у.е., на 2–3-й дни хранения — 257±74 у.е., на 4–7-й дни хранения — 264±56 у.е.

 

Рис. 4. А. Митохондриальный потенциал неактивированных тромбоцитов на разных сроках хранения концентратов тромбоцитов. Число образцов в дни исследования составило n=31–41. Б. Содержание внутриклеточного аденозинтрифосфата (АТФ) в концентратах тромбоцитов на разных сроках хранения. Концентрация АТФ нормализована на единицу массы белка в тромбоцитарных лизатах. Число образцов в дни исследования составило n=9–20. Результаты представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (А) и как медиана и интерквартильный интервал (Б)

 

Достоверных изменений концентрации АТФ в концентратах тромбоцитов в зависимости от срока хранения также не обнаружено (рис. 4, Б). В день получения концентратов медианное значение уровня АТФ составляло 0,05 пмоль на 1 мг белка (IQR 0,03–0,07; n=9), на 2–3-й дни — 0,04 пмоль/мг (IQR 0,01–0,12; n=20), на 4–6-й дни — 0,04 пмоль/мг (IQR 0,02–0,08; n=9) (общий р=0,8).

Полученные результаты свидетельствуют о жизнеспособности тромбоцитов в составе концентратов и сохраняющемся энергетическом потенциале на протяжении изученных сроков хранения.

Морфологическая характеристика тромбоцитов в концентратах. По данным сканирующей электронной микроскопии, в концентратах тромбоцитов были обнаружены разные морфологические варианты тромбоцитов, представленные на рис. 5.

 

Рис. 5. Различные морфологические варианты тромбоцитов в составе концентратов тромбоцитов по данным сканирующей электронной микроскопии: А — дисковидные; Б — овальные; В — недеформированные или слегка деформированные с 1–3 филоподиями; Г — сильно деформированные с множественными филоподиями; Д — сферические с шероховатой поверхностью; Е — веретенообразные. Линейки = 1 мкм

 

Дисковидные (см. рис. 5, А) и овальные (см. рис. 5, Б) тромбоциты с гладкой поверхностью, без каких-либо выпячиваний и филоподий, представляют собой покоящиеся, неактивированные тромбоциты. Такие тромбоциты преобладали, их доля в концентратах составляла на 1-й день 30% (IQR 22–38%), на 2–3-й дни — 33% (IQR 20–44%), на 4–7-й дни — 32% (IQR 21–48%). Содержание дисковидных тромбоцитов в процессе хранения существенно не менялось, медианная доля на 1-й день составляла 28% (IQR 14–35%), на 2–3-й день — 17% (IQR 8–24%, p <0,005 по сравнению с 1-м днём), на 4–7-й дни — 23% (IQR 16–31%, p <0,0001 по сравнению с 2–3-м днём). Медианная доля овальных тромбоцитов в 1-й день составляла 1% (IQR 0–3%), на 2–3-й день их содержание увеличилось до 15% (IQR 4–23%, p <0,0001), на 4–7-й дни — до 10% (IQR 3–18%, p <0,0001 по сравнению с 1-м днём).

Вторую группу образовывали недеформированные или слегка деформированные тромбоциты с 1–3 короткими филоподиями (см. рис. 5, В), которые служат морфологическим признаком частичной активации тромбоцита. Медианная доля тромбоцитов с филоподиями составляла на 1-й день 38% (IQR 22–55%), на 2–3-й день — 23% (IQR 13–37%, p <0,001 по сравнению с 1-м днём), на 4–7-й дни — 20% (IQR 13–41%, p <0,0001 по сравнению с 1-м днём).

Третья разновидность — сильно деформированные тромбоциты, полностью утратившие дисковидную форму, с неровной поверхностью и множественными короткими или длинными филоподиями (см. рис. 5, Г), что характерно для тромбоцитов с высокой степенью активации. Их медианная доля на 1-й день составляла 27% (IQR 12–35%), на 2–3-й дни — 12% (IQR 0–23%, p <0,0001 по сравнению с 1-м днём), на 4–7-й дни — 22% (IQR 0–34%, p <0,0001 по сравнению с 1-м днём).

Важным морфологическим признаком прогрессирующей спонтанной активации тромбоцитов в процессе хранения концентратов было появление тромбоцитарных микроагрегатов, которые содержали от 2 до 15 клеток. Агрегаты обнаруживались на 3–7-й дни хранения концентратов и содержали 0,5–1,6% всех тромбоцитов. В составе микроагрегатов преобладали сферические тромбоциты (33–100%), а также активированные тромбоциты с филоподиями (9–33%). Образование тромбоцитарных агрегатов обусловливает прогрессирующее снижение доли изолированных, неагрегированных тромбоцитов с морфологическими признаками активации (деформированные тромбоциты с филоподиями), обнаруживаемых в тромбоконцентратах в процессе хранения.

Кроме описанных типичных, или «классических», морфологических вариантов тромбоцитов, в концентратах обнаружены тромбоциты с атипичной морфологией. К ним относятся небольшие сферические тромбоциты (средний диаметр 1,8±0,3 мкм), имеющие шероховатую поверхность, без филоподий (см. рис. 5, Д), а также веретенообразные, вытянутые тромбоциты (см. рис. 5, Е). Сферические тромбоциты, которых не было в день получения концентратов, появлялись только на 3–7-й дни хранения. Доля веретенообразных тромбоцитов в день получения концентратов составляла 1% (IQR 0–3%), их содержание возрастало до 3% (IQR 0–7%) на 2–3-й дни (р=0,016) и до 5% (IQR 2–9%) на 4–7-й дни (р <0,0001 по сравнению с 1-м днём). Предположительно сферические и веретенообразные структуры — разновидность активированных тромбоцитов, подвергшихся механическим и/или химическим воздействиям в процессе получения концентратов. Активация тромбоцитов может проявляться как в повышенной реактивности, так и во вторичной дисфункции вплоть до рефрактерности вследствие истощения функциональных резервов.

Обсуждение

Учитывая большое количество факторов, влияющих на качество и лечебную эффективность тромбоцитарных препаратов, целью настоящей работы было комплексное изучение динамики морфофункционального состояния тромбоцитов в процессе хранения концентрата тромбоцитов на сроках до 7 дней.

Одним из важных результатов исследования является то обстоятельство, что в процессе хранения концентратов тромбоцитов постепенно повышается спонтанная экспрессия Р-селектина (см. рис. 1, А) и фосфатидилсеринов (см. рис. 1, А), что указывает на фоновую активацию нестимулированных тромбоцитов. Этот результат сопоставим с наблюдениями большинства исследователей, которые также показали, что экспрессия Р-селектина [17, 18] и фосфатидилсеринов [17] на поверхности тромбоцитов увеличивалась с течением времени. В то же время есть исследование, в котором 7-дневное хранение концентратов тромбоцитов не сопровождалось заметной спонтанной экспрессией Р-селектина, а экспрессия фосфатидилсеринов повышалась незначительно [19].

К результатам процитированной работы [19] приближаются наши данные о том, что экспрессия активного интегрина αIIbβ3 остаётся почти неизменной на протяжении всего срока хранения (см. рис. 1, А); такие же результаты получены в работе Sperling и соавт. [18]. В целом, несмотря на некоторые противоречия, опубликованные результаты исследования покоящихся, неактивированных тромбоцитов отчётливо указывают на прогрессирующую активацию в процессе хранения концентратов тромбоцитов, что подтверждается нашими данными.

Важнейшая функциональная характеристика тромбоцитов — их реактивность, то есть способность отвечать на внешние биохимические стимулы. В нашем исследовании при стимуляции тромбоцитов тромбиноподобным пептидом TRAP-6 и кальциевым ионофором A23187 происходило постепенное понижение индуцированной экспрессии Р-селектина, активного интегрина и фосфатидилсеринов по сравнению с днём получения концентратов, что свидетельствует о прогрессирующей потере реактивности тромбоцитов в процессе хранения. На это же указывает постепенное снижение агрегационного ответа тромбоцитов на такие индукторы, как коллаген и TRAP (см. рис. 2), что совпадает с результатами других исследователей [17–20].

В дополнение к данным по экспрессии молекулярных маркёров активации и агрегационной способности тромбоцитов было обнаружено, что в процессе хранения концентратов многие тромбоциты утрачивают исходную дисковидную форму и приобретают другие, в том числе атипичные структурные характеристики. Эти новые морфологические варианты отражают частичную активацию тромбоцитов, что подтверждает данные литературы [21].

К числу неожиданных и важных результатов нашего исследования относится постоянство митохондриального потенциала тромбоцитов и концентрации внутриклеточного АТФ в процессе хранения (см. рис. 4). Учитывая, что контрактильный аппарат тромбоцитов, образованный комплексом немышечного миозина IIA и актина, использует исключительно энергию АТФ [22], эти данные в совокупности указывают на сохранение энергетического потенциала тромбоцитов, по крайней мере, до 7 дней хранения. Аналогичные результаты о сохранении митохондриального потенциала тромбоцитов в процессе хранения при одновременном повышении экспрессии молекулярных маркёров активации были описаны в работе Perrotta и ­соавт. [23].

Заключение

Полученные данные свидетельствуют о том, что, несмотря на некоторую степень прогрессирующей фоновой активации тромбоцитов и относительное снижение реактивности, подавляющее большинство тромбоцитов в составе концентратов сохраняет жизнеспособность и функциональность до 7 дней хранения при комнатной температуре в присутствии добавочного раствора SSP+.

Практическая ценность исследования заключается в том, что, согласно полученным результатам, заметные изменения морфофункционального состояния тромбоцитов начинаются только после 3-го дня хранения, поэтому свежеполученные концентраты обладают наибольшей лечебной эффективностью. Важно отметить, что тромбоциты в целом сохраняют энергетический потенциал и основные функциональные характеристики, включая контрактильную активность, до 7 дней хранения при комнатной температуре. Полученные результаты обосновывают лечебную эффективность концентратов тромбоцитов как гемостатических средств и служат основанием для оптимизации сроков и условий хранения препаратов.

Выводы

1. Тромбоциты в составе концентратов изначально обладают высоким функциональным потенциалом, который постепенно снижается вследствие прогрессирующей спонтанной активации при одновременном снижении реактивности и изменениях структуры.
2. Наибольшей стабильностью отличаются энергетический потенциал и сократительная способность тромбоцитов.

 

Участие авторов. Р.И.Л. — руководство работой, обработка и анализ данных, написание статьи; Л.С.Ф. — сбор исследуемого материала; А.И.Х. — проведение исследований, обработка и анализ данных, написание статьи; И.А.А. — проведение исследований, обработка и анализ данных; Н.Г.Е. — проведение исследований.
Источник финансирования. Работа выполнена при поддержке Программы стратегического академического лидерства Казанского (Приволжского) федерального университета (ПРИОРИТЕТ-2030). Проточная цитометрия и сканирующая электронная микроскопия тромбоцитов были проведены за счёт средств гранта Российского научного фонда №21-75-00010.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.
Благодарности. Авторы выражают благодарность компании ООО «ГемаКор» (Москва) за предоставление регистратора тромбодинамики, использованного в данной работе для изучения контракции сгустков. Авторы также выражают благодарность фирме ООО «Технология Стандарт» (Барнаул) за безвозмездно предоставленный реактив — ­коллаген.

About the authors

Alina I. Khabirova

Institute of Fundamental Medicine and Biology

Author for correspondence.
Email: alina.urussu.95@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7243-8832
ResearcherId: AAO-3282-2021

Junior Researcher, Research Laboratory “Protein-Cell Interactions”, Institute of Fundamental Medicine and Biology

Russian Federation, Kazan, Russia

Luciya S. Fatkhullina

Interregional Clinical Diagnostic Center

Email: Lusik65@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-8303-7455

M.D., Head, Depart. of Procurement of Blood and Its Components

Russian Federation, Kazan, Russia

Izabella A. Andrianova

Institute of Fundamental Medicine and Biology

Email: izabella2d@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3973-3183

Cand. Sci. (Biol.), Senior Researcher, Research Laboratory “Protein-Cell Interactions”, Institute of Fundamental Medicine and Biology

Russian Federation, Kazan, Russia

Natalia G. Evtugina

Institute of Fundamental Medicine and Biology

Email: natalja.evtugyna@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4950-3691

PhD Stud., Depart. of Biochemistry, Biotechnology and Pharmacology, Institute of Fundamental Medicine and Biology

Russian Federation, Kazan, Russia

Rustem I. Litvinov

Institute of Fundamental Medicine and Biology

Email: rustempa@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0643-1496

M.D., D. Sci. (Med.), Prof., Chief Researcher, Research Laboratory “Protein-Cell Interactions”, Institute of Fundamental Medicine and Biology

Russian Federation, Kazan, Russia

References

Supplementary files