Recognition of mutant forms of the sodium-dependent phosphate transporter NaPi2b by ­monoclonal antibodies in ovarian cancer cells

Full Text

Актуальность

Натрий-зависимый фосфатный транспортёр NaPi2b (SLC34A2, NaPi-IIb, Npt2) принадлежит к семейству транспортёров SLC34 и принимает участие в поддержании фосфатного гомеостаза в организме человека путём переноса неорганического фосфата внутрь клетки [1]. В организме человека фосфатный транспортёр NaPi2b экспрессируется в тонкой кишке, лёгких, щитовидной, слюнной и молочной железах, семенниках, печени, костях и зубах. Повышенная экспрессия фосфатного транспортёра NaPi2b обнаружена в клетках карциномы яичника [2–4], лёгкого [5, 6], колоректального рака [7], рака щитовидной железы [8] и других видов злокачественных новообразований, что делает его привлекательной мишенью для противоопухолевой терапии.

Транспортёр NaPi2b — интегральный мембранный белок с несколькими трансмембранными доменами, большим внеклеточным доменом (ВКД) с предполагаемыми границами 188–361 а.о., а также С- и N-концевыми доменами, предположительно расположенными в цитоплазме [9]. В состав ВКД транспортёра NaPi2b входят четыре аминокислотных остатка цистеина — С303, С322, С328 и С350, а также несколько потенциальных сайтов N- и О-гликозилирования, роль которых до конца не изучена [9].

Натрий-зависимый фосфатный транспортёр NaPi2b был идентифицирован в качестве мишени для моноклональных антител MX35 [9, 10], на основе которых были созданы и в настоящее время проходят клинические испытания гуманизированные антитела XMT-1536 (NCT03319629) и ХМТ-1592 (NCT04396340) для лечения рака яичника и лёгкого. Эпитоп, который распознают моноклональные антитела МХ35 (эпитоп МХ35), был идентифицирован в районе ВКД транспортёра NaPi2b в пределах 324–338 а.о. [9].

Интересная особенность распознавания эпитопа МХ35 антителами МХ35 [11] и антителами L2(20/3) [10], которые распознают один и тот же участок ВКД (324–338 а.о.), — чувствительность к восстанавливающим агентам типа дитиотреитола (ДТТ) исключительно в клетках эукариот [10, 12]. Одним из объяснений наблюдаемого феномена может служить вероятное образование дисульфидных связей между четырьмя остатками цистеина, находящимися в составе ВКД транспортёра NaPi2b в положениях 303, 322, 328 и 350, что обеспечивает поддержание конформации ВКД и эпитопа MX35, необходимых для распознавания антителами MX35 и L2(20/3). В работе Yin и соавт. показано, что наиболее вероятно образование ди­сульфидной связи между остатками цистеинов в положениях 303 и 350 [9].

Цель

Учитывая тот факт, что NaPi2b — привлекательный объект для противоопухолевой терапии и мишень для ряда терапевтических антител, целью нашего исследования стало изучение особенностей распознавания эпитопа MX35 моноклональными антителами L2(20/3) в мутантных формах транспортёра NaPi2b и получение поликлональных антител, направленных против экстрамембранных доменов NaPi2b.

Материал и методы исследования

Получение поликлональных антител. Для получения поликлональных антител мышей линии ВАLВ/с 8-недельного возраста иммунизировали 4 раза инъекциями антигена в брюшную полость. Работа с животными одобрена локальным этическим комитетом ­ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» в соответствии с протоколом №34
от 27.01.2022. В качестве антигена использовали очищенный рекомбинантный N-концевой фрагмент NaPi2b (1–100 а.о.) и очищенный рекомбинантный фрагмент ВКД NaPi2b
(­291–361 а.о.).

Гены, кодирующие фрагменты NaPi2b, были клонированы в вектор pET28b. Экспрессию рекомбинантных фрагментов NaPi2b проводили в клетках E. coli штамма BL21(DE3) и очищали методом металл-хелатной аффинной хроматографии с использованием Ni-NTA агарозы.

Первую иммунизацию делали с использованием 20 мкг высокоочищенного рекомбинантного антигена в 300 мкл 50% раствора полного адъюванта Фрейнда в фосфатно-солевом буфере. Для второй и третьей иммунизации брали по 20 мкг антигена в 300 мкл 50% раствора неполного адъюванта Фрейнда в фосфатно-­солевом буфере и проводили иммунизацию с интервалом 2 нед. Последнюю усиливающую иммунизацию мышей «booster» проводили 20 мкг антигена в 300 мкл фосфатно-солевого буфера без адъюванта.

Титр специфических антител в сыворотке крови иммунизированных мышей определяли с помощью иммуноферментного анализа. Спленоциты, выделенные из иммунизированных мышей, были заморожены для получения в дальнейшем гибридомы для производства моноклональных антител.

Клеточные линии и антитела. Для работы использовали клеточные линии рака яичника человека: OVCAR-8 (ATCC, США), в которой отсутствует эндогенная экспрессия транспортёра NaPi2b [12], и OVCAR-4 (ATCC, США), эндогенно экспрессирующую транспортёр NaPi2b дикого типа [12] в качестве положительного контроля. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 (Панэко, Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, при 37 °С в атмосфере 5% CO2.

Для распознавания мутантных форм фосфатного транспортёра NaPi2b в вестерн-блот анализе и проточной цитометрии использовали первичные мышиные моноклональные антитела L2(20/3) [13], распознающие эпитоп MX35 в составе ВКД транспортёра NaPi2b, и антитела N-NaPi2b (15/1), направленные против N-концевого домена NaPi2b [14]. Для контроля загрузки белка при проведении вестерн-блот анализа использовали первичные моноклональные мышиные антитела против глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH; HyTest, Россия). В качестве вторичных антител использовали моноклональные антитела козы против Fc-фрагментов мышиных антител, конъюгированные с пероксидазой хрена или с флюоресцентной меткой Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific, США).

Сайт-направленный мутагенез. Для получения рекомбинантных плазмид, кодирующих гены мутантных форм транспортёра NaPi2b с заменой остатков цистеина на остатки аланина в положениях 303 и 350, проводили сайт-направленный мутагенез с использованием набора реактивов Quick Change II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent, США) в соответствии с методическими рекомендациями производителя. В качестве матрицы для создания мутантных конструктов использовали рекомбинантную плазмиду pcDNA3.1(+)/NaPi2b, кодирующую ген дикого типа фосфатного транспортёра NaPi2b (SLC34A2, NM_006424.2). Целевые мутации в полученных плазмидах были подтверждены с помощью секвенирования по методу Сэнгера.

Трансфекция. Транзиентную трансфекцию клеток OVCAR-8 проводили плазмидой pcDNA 3.1+/NaPi2b_C303A и pcDNA 3.1+/NaPi2b_C350A с помощью трансфицирующего агента JetPRIME (Polyplus, США) в соответствии с рекомендациями производителя. В качестве положительного контроля клетки OVCAR-8 трансфицировали плазмидой pcDNA 3.1+/NaPi2b_Дикий тип.

Вестерн-блот анализ. Для проведения вестерн-блот анализа из клеток OVCAR-8, эктопически экспрессирующих рекомбинантные мутантные формы транспортёра NaPi2b в результате транзиентной трансфекции, получали лизаты и выделяли белковые фракции для приготовления образцов. Для оценки ­вклада дисульфидных связей в распознавание эпитопа MX35 моноклональными антителами L2(20/3) при приготовлении образцов использовали два варианта загрузочного буфера: с ДТТ и без него. Для оценки общего уровня экспрессии NaPi2b в образцах использовали антитела N-NaPi2b (15/1) против N-концевого домена NaPi2b, распознавание которого не зависит от добавления ДТТ. В качестве положительного контроля использовали образцы, полученные из клеточной линии OVCAR-4, эндогенно экспрессирующей дикий тип транспортёра NaPi2b.

Вертикальный электрофорез белков проводили в 10% полиакриламидном геле с использованием камеры MINI-Protean TETRA (BIO-RAD, США). Блоттинг белков с геля на PVDF мембрану осуществляли с помощью мокрого переноса с использованием трансфер-буфера (трис основной 0,25 М, глицин 1,92 М, метанол 20%, pH 8,3).

Блокировку мембраны проводили в 5% растворе бычьего сывороточного альбумина в буфере ТБС (трис основной 0,05 М, NaCl 0,149 M, Твин-20 0,05%). После блокировки мембрану инкубировали последовательно с первичными и вторичными антителами c промежуточными отмывками. Детекцию сигнала на мембране проводили с помощью хемилюминесцентного детектора ChemiDoc (BIO-RAD, США).

Проточная цитометрия. Клетки OVCAR-8, прикреплённые к культуральной посуде и эктопически экспрессирующие рекомбинантные мутантные формы или дикий тип транспортёра NaPi2b в результате транзиентной трансфекции, преинкубировали с мышиными моноклональными антителами L2(20/3) в течение 1 ч. Дальнейшую подготовку образцов проводили по стандартному протоколу для проточной цитометрии живых клеток (BestProtocols: Cell Preparation for Flow Cytometry Protocols, Thermo Fisher).

Для контроля эффективности трансфекции и уровня экспрессии транспортёра NaPi2b в клетках OVCAR-8 проводили детекцию его N-концевого домена антителами N-NaPi2b (15/1) в образцах, фиксированных 2% раствором формальдегида и пермеабилизованных 0,1% раствором тритона X-100.

В качестве вторичных антител использовали антитела козы против мышиных иммуноглобулинов, меченные Alexa Fluor 488. Для контроля целостности плазматической мембраны применяли краситель йодистый пропидий, который не способен проникать в живые клетки с неповреждённой мембраной.

Регистрацию флюоресцентного сигнала проводили на проточном ­цитофлуориметре BD FACS Aria III (BD Biosciences, США). Для каждого образца анализировали не менее 10 000 единичных событий. Количество клеток, которые распознаются моноклональными антителами с учётом эффективности трансфекции (X), рассчитывали по формуле:

X= ВКД_пол×100%/ВКД_общ,

где X — количество клеток, которые распознаются моноклональными антителами с учётом эффективности трансфекции; ВКДпол — количество живых трансфицированных клеток OVCAR-8, положительных по окраске антителами L2(20/3); ВКД_общ — общее количество проанализированных живых трансфицированных клеток OVCAR-8 в образце, окрашенном антителами L2(20/3), с учётом эффективности трансфекции.

Эффективность трансфекции оценивали по доле клеток OVCAR-8, положительных по окраске антителами N-NaPi2b (15/1), в фиксированных и пермеабилизованных образцах после транзиентной трансфекции.

Статистическую обработку данных проточной цитометрии проводили с применением χ2 Пирсона с поправкой Йейтса с учётом эффективности трансфекции.

Результаты

Создание и вестерн-блот анализ мутантных форм натрий-зависимого фосфатного транспортёра NaPi2b с заменой остатков цистеина в положениях 303 и 350 на остатки аланина. Нами были получены генетические конструкты, кодирующие мутантные варианты транспортёра NaPi2b с заменами остатков цистеина на остатки аланина в положениях 303 (NaPi2b_C303A) и 350 (NaPi2b_C350A). Замены кодонов цистеина на кодоны аланина в полученных генетических конструктах были подтверждены с помощью секвенирования по Cэнгеру. ­Последовательности праймеров, которые были использованы для сайт-направленного мутагенеза, представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров для получения конструктов, кодирующих мутантные формы натрий-зависимого фосфатного транспортёра NaPi2b

Название ­мутантной ­формы NaPi2b	Название плазмиды	Нуклеотидная последовательность праймеров (5’→3’)
NaPi2b_C303A	pcDNA3.1(+)/NaPi2b-C303A	Праймер прямой: caagagtcttgtcaagatttgggccaaaacttttaccaacaagacc
		Праймер обратный: ggtcttgttggtaaaagttttggcccaaatcttgacaagactcttg
NaPi2b_C350A	pcDNA3.1(+)/NaPi2b-C350A	Праймер прямой: cctacaaggagaacatcgccaaagcccagcatatctttgt
		Праймер обратный: acaaagatatgctgggctttggcgatgttctccttgtagg

Примечание. В последовательностях праймеров триплеты с целевыми мутациями выделены полужирным шрифтом.

 

Для изучения влияния остатков цистеина С303 и C350 ВКД транспортёра NaPi2b на распознавание эпитопа MX35 антителами L2(20/3) в вестерн-блот анализе рекомбинантные мутантные формы транспортёра NaPi2b эктопически экспрессировали в клеточной линии рака яичника человека OVCAR-8 с помощью транзиентной трансфекции. В качестве контролей использовали образцы, полученные из клеточной линии рака яичника OVCAR-4, эндогенно экспрессирующей транспортёр NaPi2b дикого типа, а также нетрансфицированных клеток ­линии OVCAR-8.

Результаты вестерн-блот анализа антителами N-NaPi2b (15/1) подтвердили наличие эктопической экспрессии всех рекомбинантных форм NaPi2b в клетках OVCAR-8 после транзиентной трансфекции (рис. 1, А). Молекулярная масса всех рекомбинантных мутантных форм NaPi2b соответствовала гликозилированной форме дикого типа транспортёра NaPi2b (около 100 кДа). Следует отметить, что эктопическая экспрессия мутантных форм NaPi2b, детектируемая антителами N-NaPi2b (15/1), была невысокой, что свидетельствует о низкой эффективности трансфекции либо возможной нестабильности/деградации мутантных по цистеинам С303 и С350 форм транспортёра NaPi2b в клетках.

При проведении вестерн-блот анализа антителами L2(20/3), распознающими эпитоп MX35 транспортёра NaPi2b, специфический сигнал наблюдали только для образцов, полученных из клеток OVCAR-4, экспрессирующих дикий тип транспортёра NaPi2b, не обработанных ДТТ (рис. 1, Б). На рис. 1, Б ясно видно, что замена каждого из исследуемых остатков цистеина в мутантных формах NaPi2b приводила к отсутствию специфичного сигнала от антител L2(20/3) как при обработке образцов ДТТ, так и, что самое важное, без обработки ДТТ. То есть замены остатков цистеина С303 и С350 имитируют восстановление дисульфидных связей, образуемых между ними, результатом чего становится исчезновение сигнала в вестерн-блот анализе антителами L2(20/3) даже без добавления ДТТ.

 

Рис. 1. Вестерн-блот анализ мутантных форм натрий-зависимого фосфатного транспортёра NaPi2b c заменами цистеинов на аланин в положениях 303 и 350 в клетках рака яичника OVCAR-8. А. Анализ с моноклональными антителами N-NaPi2b (15/1); Б. Анализ с моноклональными антителами L2(20/3); ДТТ — дитиотреитол; GAPDH — глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

 

Полученные данные позволяют сделать заключение об участии остатков цистеина С303 и C350 в образовании дисульфидной связи, имеющей ключевое значение для формирования конформации ВКД фосфатного транспортёра NaPi2b, которая влияет на распознавание эпитопа МХ35 транспортёра NaPi2b моноклональными антителами L2(20/3).

Получение и проверка поликлональных антител против ВКД и N-концевого домена натрий-зависимого фосфатного транспортёра NaPi2b. Поскольку транспортёр NaPi2b представляет собой привлекательную мишень для противоопухолевой терапии, важной задачей является получение антител против других эпитопов экстрамембранных доменов транспортёра NaPi2b. В связи с этим было решено получить и проверить поликлональные антитела против ВКД и N-концевого домена транспортёра NaPi2b.

Для получения поликлональных антител использовали рекомбинантные очищенные фрагменты N-концевого домена NaPi2b (1–100 а.о.) и ВКД NaPi2b (311–340 а.о.). В результате нами были получены поликлональные антитела pL-NaPi2b, направленные против ВКД NaPi2b, и поликлональные антитела pN-NaPi2b, направленные против N-концевого домена NaPi2b. Согласно результатам иммуноферментного анализа титр выделенных поликлональных антител составил не менее 1:10 000–1:100 000.

Полученные поликлональные антитела были проверены в вестерн-блот анализе на клетках рака яичника, экспрессирующих транспортёр NaPi2b (OVCAR-4) и не экспрессирующих транспортёр NaPi2b (OVCAR-8), с добавлением восстанавливающего агента ДТТ и без него (рис. 2). Сигнал от поликлональных антител pN-NaPi2b и pL-NaPi2b, соответствующий транспортёру NaPi2b дикого типа, был зарегистрирован только в образцах клеток OVCAR-4 и отсутствовал в образцах клеток OVCAR-8 (см. рис. 2, А, Б). При этом при обработке образцов ДТТ специфический сигнал от антител pL-NaPi2b исчезает, но сохраняется при анализе с антителами pN-NaPi2b.

 

Рис. 2. Вестерн-блот анализ лизатов клеток рака яичника OVCAR-4 и OVCAR-8. А. Анализ с поликлональными антителами pN-NaPi2b. Б. Анализ с поликлональными антителами pL-NaPi2b; ДТТ — дитиотреитол; GAPDH — глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

 

Анализ распознавания эпитопа MX35 в цистеиновых мутантных формах натрий-зависимого фосфатного транспортёра NaPi2b моноклональными антителами L2(20/3) с помощью проточной цитометрии. Изучение влияния остатков цистеина в положениях 303 и 350 в области ВКД фосфатного транспортёра NaPi2b на распознавание эпитопа MX35 антителами L2(20/3) методом проточной цитометрии осуществляли на живых клетках OVCAR-8, эктопически экспрессирующих рекомбинантные мутантные формы или дикий тип транспортёра NaPi2b в результате транзиентной трансфекции. Эффективность трансфекции оценивали по количеству клеток OVCAR-8, имеющих позитивное окрашивание N-концевого домена NaPi2b в фиксированных и пермеабилизованных образцах после транзиентной трансфекции.

Доступность эпитопа MX35 транспортёра NaPi2b для антител L2(20/3) при замене остатков цистеина С303 и С350 на остатки аланина оценивали по изменению доли положительно окрашенных антителами L2(20/3) живых клеток OVCAR-8, экспрессирующих мутантные формы NaPi2b, по сравнению с клетками OVCAR-8, экспрессирующими дикий тип NaPi2b, с учётом эффективности трансфекции.

Согласно результатам проточной цитометрии (рис. 3, А–Г) доля живых клеток OVCAR-8, экспрессирующих транспортёр NaPi2b дикого типа и позитивно окрашенных антителами L2(20/3), составляла 56% (рис. 3, Д). В то время как доля живых клеток OVCAR-8, экспрессирующих мутантную форму NaPi2b_C303A и позитивно окрашенных антителами L2(20/3), составила 23% (см. рис. 3, Д). При этом эффективность трансфекции клеток OVCAR-8 конструктом, кодирующим дикий тип NaPi2b, составила 53,8% (см. рис. 3, В), а эффективность трансфекции клеток OVCAR-8, то есть доля клеток, экспрессирующих мутантную форму NaPi2b_C303A, составила 47,9% (см. рис. 3, Г).

 

Рис. 3. Анализ мутантных форм натрий-зависимого фосфатного транспортёра NaPi2b с помощью проточной цитометрии. А–Г. Точечные диаграммы результатов проточной цитометрии клеток рака яичника OVCAR-8, эктопически экспрессирующих NaPi2b дикого типа (А, В) и его мутантную форму (Б, Г) с заменой остатка цистеина С303 на остаток аланина (NaPi2b_C303A). А и Б. Анализ с моноклональными антителами L2(20/3). В и Г. Анализ с моноклональными антителами N-NaPi2b (15/1). Д. Мозаичный плот сравнения распознавания эпитопа MX35 NaPi2b дикого типа и его мутантной формы NaPi2b_C303A антителами L2(20/3). Статистический анализ выполнен с помощью критерия χ2 Пирсона с поправкой Йейтса; ***p <0,001

 

В эксперименте с мутантной формой NaPi2b_C350A доля клеток OVCAR-8, экспрессирующих транспортёр дикого типа, составила 85,1% (рис. 4, В), а мутантную форму NaPi2b_C350A — 89,0% (рис. 4, Г). При этом с учётом эффективности трансфекции доля живых клеток OVCAR-8, экспрессирующих транспортёр NaPi2b дикого типа и позитивно окрашенных антителами L2(20/3), составляла 39 и 25% для мутантной формы транспортёра NaPi2b_C350A (рис. 4, Д).

 

Рис. 4. Анализ мутантных форм натрий-зависимого фосфатного транспортёра NaPi2b с помощью проточной цитометрии. А–Г. Точечные диаграммы результатов проточной цитометрии клеток рака яичника OVCAR-8, эктопически экспрессирующих NaPi2b дикого типа (А, В) и его мутантную форму (Б, Г) с заменой остатка цистеина С350 на остаток аланина (NaPi2b_C350A). А и Б. Анализ с моноклональными антителами L2(20/3). В и Г. Анализ с моноклональными антителами N-NaPi2b (15/1). Д. Мозаичный плот сравнения распознавания эпитопа MX35 NaPi2b дикого типа и его мутантной формы NaPi2b_C350A антителами L2(20/3). Статистический анализ выполнен с помощью критерия χ2 Пирсона с поправкой Йейтса; ***p <0,001

 

Таким образом, показано, что замена каждого из остатков цистеина в положениях 303 и 350 на остатки аланина приводит к уменьшению распознавания эпитопа MX35 моноклональными антителами L2(20/3) в цистеиновых мутантных формах NaPi2b_C303A и NaPi2b_C350A по сравнению c диким типом транспортёра NaPi2b (см. рис. 3 и 4).

Обсуждение

Изучение особенностей распознавания мембранных белков моноклональными антителами в опухолевых клетках — актуальная задача как для современной трансляционной медицины, так и для фундаментальной науки. Натрий-зависимый фосфатный транспортёр NaPi2b является одной из перспективных мишеней для противоопухолевой терапии, поскольку в составе его ВКД содержится эпитоп MX35 [9], который служит мишенью для ряда терапевтических антител, проходящих клинические испытания для лечения опухолевых заболеваний. Среди них гуманизированные антитела XMT-1536 (NCT03319629) и ХМТ-1592 (NCT04396340), разработанные на основе антител МХ35, для лечения рака яичника и рака лёгкого.

Поскольку распознавание эпитопа MX35 антителами МХ35 и L2(20/3) зависит от обработки восстанавливающими агентами, мы предположили, что доступность эпитопа MX35 для антител обеспечивается конформацией ВКД транспортёра NaPi2b, поддерживаемой дисульфидными связями между остатками цистеина С303 и С350, входящими в состав ВКД NaPi2b. Мы показали, что замена остатков цистеина на остатки аланина как в положении 303, так и в положении 350 приводит к исчезновению распознавания эпитопа MX35 моноклональными антителами L2(20/3) в условиях вестерн-блот анализа даже без добавления ДТТ, напоминая эффект обработки ДТТ образцов, полученных из клеток, экспрессирующих эндогенный транспортёр дикого типа (см. рис. 1).

При проведении проточной цитометрии интактных клеток рака яичника OVCAR-8, эктопически экспрессирующих транспортёр NaPi2b дикого типа и его мутантные формы, антитела L2(20/3) распознают эпитоп MX35 в мутантных формах NaPi2b в меньшем количестве клеток по сравнению с диким типом транспортёра NaPi2b (см. рис. 3 и 4).

Полученные данные позволяют предположить, что между остатками цистеина в положениях 303 и 350 формируется дисульфидная связь, отвечающая за конформацию ВКД транспортёра NaPi2b, обеспечивающую доступность эпитопа МХ35 для моноклональных антител. Полученные данные дают возможность сделать предположение, что когда дисульфидная связь 303–350 нарушается, конформация ВКД транспортёра NaPi2b в клетках рака яичника меняется таким образом, что эпитоп MX35 становится полностью недоступен для антител L2(20/3) в условиях вестерн-блот анализа и частично недоступен в условиях цитометрии.

Нами были получены поликлональные антитела pL-NaPi2b и pN-NaPi2b, направленные против ВКД транспортёра NaPi2b и его N-концевого домена соответственно. Было показано, что при проведении вестерн-блот анализа образцов, полученных из клеток OVCAR-4, поликлональные антитела pL-NaPi2b оказались чувствительны к добавлению ДТТ, в то время как поликлональные антитела pN-NaPi2b не показали такой явной зависимости от добавления ДТТ к исследуемым образцам. Полученные данные свидетельствуют о том, что поликлональные антитела pL-NaPi2b, вероятно, распознают тот же эпитоп МХ35, чувствительный к ДТТ, что и антитела L2(20/3), что свидетельствует о его сильной иммуногенности.

Таким образом, несмотря на то обстоятельство, что остатки цистеина С303 и С350 не входят в состав предполагаемого эпитопа MX35 (324–338 а.о.), они критичны для обеспечения конформации ВКД натрий-зависимого фосфатного транспортёра NaPi2b, которая влияет на распознавание эпитопа MX35 моноклональными антителами.

Полученные нами результаты как представляют интерес для фундаментальной науки, так и имеют большую практическую значимость для понимания процесса узнавания терапевтическими антителами мембранного транспортёра NaPi2b в опухолевых клетках.

Выводы

1. Замена остатков цистеина в положениях 303 и 350 во внеклеточном домене натрий-зависимого фосфатного транспортёра NaPi2b приводит к исчезновению распознавания эпитопа MX35 в цистеиновых мутантных формах NaPi2b в вестерн-блот анализе и уменьшению распознавания этих мутантных форм в проточной цитометрии моноклональными антителами L2(20/3).
2. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что остатки цистеина в положениях 303 и 350 участвуют в образовании дисульфидной связи, которая обеспечивает конформацию внеклеточного домена, влияющую на распознавание эпитопа MX35 натрий-зависимого фосфатного транспортёра NaPi2b моноклональными антителами L2(20/3).

 

Участие авторов. Л.Ф.Б., В.С.С., М.В.Б. и Р.Г.К. — концепция и дизайн исследования; Л.Ф.Б. и А.В.К. — экспериментальное исследование; Л.Ф.Б., В.С.С. и Р.Г.К. — анализ и интерпретация данных, написание статьи; Р.Г.К. — руководство работой.
Источник финансирования. Работа выполнена при поддержке Программы стратегического академического лидерства Казанского (Приволжского) федерального университета (ПРИОРИТЕТ-2030). Анализ распознавания эпитопа MX35 c помощью проточной цитометрии и вестерн-блота выполнен за счёт средств гранта Российского научного фонда (РНФ) №20-14-00166.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

About the authors

Leisan F. Bulatova

Kazan (Volga region) Federal University

Email: bulatovalef@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-6696-8477

Junior Researcher, research laboratory “Biomarker”, Institute of Fundamental Medicine and Biology

Russian Federation, Kazan, Russia

Vera S. Skripova

Kazan (Volga region) Federal University

Email: vsskripova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6342-0390

Junior Researcher, research laboratory “Biomarker”, Institute of Fundamental Medicine and Biology

Russian Federation, Kazan, Russia

Arina V. Korotaeva

Kazan (Volga region) Federal University

Email: ArVKorotaeva@stud.kpfu.ru
ORCID iD: 0000-0002-2253-7488

Student, Institute of Fundamental Medicine and Biology

Russian Federation, Kazan, Russia

Mikhail V. Bogdanov

Kazan (Volga region) Federal University; The University of Texas Health Science Center

Email: mikhail.v.bogdanov@uth.tmc.edu
ORCID iD: 0000-0002-6093-0926

Cand. Sci. (Biol.), Senior Research Fellow, research laboratory “Biomarker”, Institute of Fundamental Medicine and Biology; Prof., Depart. of Biochemistry and Molecular Biology

United States, Kazan, Russia; Houston, USA

Ramziya G. Kiyamova

Kazan (Volga region) Federal University

Author for correspondence.
Email: kiyamova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2547-2843

D. Sci. (Biol.), Prof., Depart. of biochemistry, biotechnology and pharmacology, chief researcher, research laboratory “Biomarker”, Institute of Fundamental Medicine and Biology

Russian Federation, Kazan, Russia

References

Supplementary files