Background. The sodium-dependent phosphate transporter NaPi2b is expressed in a number of tumors and serves as a target for monoclonal antibody therapy. The NaPi2b transporter has a large extracellular domain containing 4 cysteines and an MX35 epitope recognized by the corresponding monoclonal antibodies.
Aim. To study the recognition of the MX35 epitope in cysteine mutants C303 and C350 of the sodium-dependent phosphate transporter NaPi2b by monoclonal antibodies in ovarian cancer cells.
Material and methods. Ovarian cancer cells of the OVCAR-8 line were transfected with plasmids encoding mutant forms of the NaPi2b transporter. The recognition of these forms by monoclonal antibodies was studied by Western blot and flow cytometry. Statistical analysis of flow cytometry data was performed using Pearson’s Chi-squared test with Yates’ correction.
Results. Western blot analysis of lysates of OVCAR-8 cells expressing the wild-type NaPi2b transporter demonstrated the presence of a specific signal only in samples without the addition of dithiothreitol, while in all samples with NaPi2b cysteine mutants, even without the addition of dithiothreitol, no specific signal from monoclonal antibodies was detected. The flow cytometry results showed that proportion of OVCAR-8 cells with positive staining of the MX35 epitope with antibodies is less when expressing the NaPi2b mutants compared to the wild type.
Conclusion. Cysteines C303 and C350 are involved in disulfide bonds formation, which is of key importance for the formation of the conformation of the extracellular domain of the sodium-dependent phosphate transporter NaPi2b, which ensures the MX35 epitope recognition by monoclonal antibodies.
Актуальность. Натрий-зависимый фосфатный транспортёр NaPi2b экспрессируется в ряде опухолей и служит мишенью для терапии моноклональными антителами. В составе транспортёра NaPi2b имеется большой внеклеточный домен, где располагаются 4 цистеина и эпитоп МХ35, распознаваемый соответствующими моноклональными антителами.
Цель. Изучение распознавания эпитопа MX35 в мутантных по цистеинам формах С303 и С350 натрий-¬зависимого фосфатного транспортёра NaPi2b моноклональными антителами в клетках рака яичника.
Материал и методы исследования. Клетки рака яичника линии OVCAR-8 были трансфицированы плазмидами, кодирующими мутантные формы транспортёра NaPi2b. Распознавание этих форм моноклональными антителами изучали методами вестерн-блота и проточной цитофлуориметрии. Статистическую обработку данных проточной цитометрии проводили с применением χ2 Пирсона с поправкой Йейтса.
Результаты. Вестерн-блот анализ лизатов клеток OVCAR-8, экспрессирующих транспортёр NaPi2b дикого типа, продемонстрировал наличие специфического сигнала только в образцах без добавления дитиотреитола, тогда как во всех образцах с цистеиновыми мутантами NaPi2b, даже без добавления дитиотреитола, специфического сигнала от моноклональных антител выявлено не было. Результаты проточной цитометрии показали, что доля клеток OVCAR-8 с позитивным окрашиванием эпитопа MX35 антителами меньше при экспрессии мутантных форм NaPi2b по сравнению с диким типом.
Вывод. Цистеины С303 и С350 участвуют в образовании дисульфидной связи, имеющей ключевое значение для формирования конформации большого внеклеточного домена натрий-зависимого фосфатного транспортёра NaPi2b, которая обеспечивает распознавание эпитопа MX35 моноклональными антителами.