About fibrinolytic processes in preserved blood
- Authors: Slobojankina I.K.1, Cazadze U.L.1
-
Affiliations:
- Leningrad Research Institute of Geological and Biological Problems
- Issue: Vol 53, No 2 (1972)
- Pages: 32-35
- Section: Articles
- Submitted: 20.02.2021
- Accepted: 20.02.2021
- Published: 30.03.1972
- URL: https://kazanmedjournal.ru/kazanmedj/article/view/61377
- DOI: https://doi.org/10.17816/kazmj61377
- ID: 61377
Cite item
Full Text
Abstract
Numerous studies have shown that blood loses its coagulation properties during long-term storage [1, 2, etc.]. However, the mechanism of these changes is not well understood. Along with the consumption of procoagulants during partial blood clotting during storage, a decrease in the activity of coagulation factors can be explained by the activation of fibrinolysis [3].
Keywords
Full Text
Многочисленными исследованиями показано, что кровь при длительном хранении теряет свои коагуляционные свойства [1, 2 и др.]. Однако механизм этих изменений выяснен недостаточно. Наряду с потреблением прокоагулянтов при частичном свертывании крови в процессе хранения снижение активности факторов свертывания может быть объяснено активацией фибринолиза [3].
Для изучения компонентов фибринолитической системы, их изменений в процессе хранения консервированной крови нами был использован метод Вольфа с применением фибриновых пленок двух типов [3].
I тип пленок предназначается для изучения активности плазминогена, который, превращаясь в плазмин под влиянием внесенного в центральное отверстие активатора плазминогена (стрептаза, 50 ед.), дает зоны лизиса в виде дуг (рис. 1.).
II тип пленок позволяет рассчитать плазминовую активность, обусловленную взаимодействием внутренних активаторов плазминогена исследуемого субстрата. При этом создаются оптимальные условия для внутренней активации плазминогена. Плазминовая активность индуцирует циркулярные зоны лизиса вокруг периферических отверстий. Центральное отверстие не используется (рис. 2).
Рис. 1 Активация плазминогена внешним активатором — стрептазой. В центральном отверстии — стрептаза. В периферических отверстиях (по часовой стрелке, с 1 по 12) разведенная плазма. ЕА, наименьшая концентрация плазмы, вызывающая лизис (11-е отверстие), составляет 11%.
Рис. 2. Активация плазминогена внутренними активаторами. Центральное отверстие не используется. В периферических отверстиях (по часовой стрелке, с 1 по 12) разведенная плазма. ІА, наименьшая концентрация плазмы, вызывающая циркулярный лизис (4-е отверстие), составляет 51%.
Для I типа пленок Вольф предлагает термин ЕА (extrinsicactivator) — внешний активатор, характеризующий концентрацию плазминогена в исследуемом субстрате. Для результатов фибринолиза на II типе пленок применяется термин ІА (intrinsicactivator) — внутренний активатор, определяющий плазминовую активность, обусловленную действием внутренних активаторов на собственный плазминоген плазмы.
IA / EA = наименьшая концентрация плазмы на II типе / наименьшая концентрация плазмы на I типе выражает соотношение внутренних активаторов плазминогена и плазминогенового потенциала. В том случае, если показатель ІА/ЕА увеличивается в динамике исследования, можно считать, что в плазме увеличивается концентрация плазминогена. Снижение показателя говорит об увеличении содержания внутренних активаторов фибринолиза. В норме IА/ЕА=3—14.
Приготовление фибринагаровых пластинок
I тип пленок. Реактивы: 1) буферный раствор с pH 8,5—хлористый натрий 8,5 г; 1,5 г двузамещенного фосфорнокислого калия, мертиолат 1:1000, дистиллированная вода до 800 мл. pH полученного раствора довести до 8,5 1 н. NaOH, долить дистиллированной водой до 1 л; 2) агар-агар 1%: 1 г агар-агара заливают на сутки дистиллированной водой, которую меняют несколько раз. Воду сливают, добавляют к агар- агару 100 мл буферного раствора с pH 8,5 и кипятят в водяной бане до полного расплавления; 3) фибриноген 2%: 200 мг сухого фибриногена растворяют в 10 мл буфера с pH 8,5.Фибрин-агаровые пленки: в горячую баню (водяную) помещают цилиндр на 50 мл, в него вводят 13 мл расплавленного агар-агара и при температуре внутри цилиндра 70° добавляют 0,7 мл 2% раствора фибриногена. Полученную смесь перемешивают термометром в течение 15 мин. при постоянной температуре. Как только раствор фибриногена приходит в контакт с горячим агар-агаром, образуется суспензия однородной, мутности. После инкубации фибрин-агаровую смесь разливают в стерильные чашки Петри (8х8) по 6,5 мл. Оставляют при комнатной температуре для застывания.
II тип пленок. Реактивы: 1) буферный раствор с pH 8,5; уксуснокислый аммоний 3,08 г; мертиолат 1:1000; дистиллированная вода до 800 мл. В полученном растворе доводят pH до 8,5 1 н. NaOH, доливают дистиллированной водой до 1 л. Остальные ингредиенты готовят так же, как для 1 типа пленок.
Для проведения исследований на фибриновых пленках обоих типов металлическими резцами делают 12 периферических отверстий, расположенных по 6 вокруг двух центральных. Диаметр центрального отверстия — 8 мм, периферического — 4 мм. Минимальное расстояние между центральным и периферическим отверстием — 7 мм. В периферические отверстия вносят стерильной пипеткой 0,05 мл исследуемой плазмы, разведенной соответственно буфером для I и II типа пленок. В первое периферическое отверстие помещают 0,05 мл цельной плазмы, во второе — 0,05 мл плазмы, разведенной 4:1 буфером по отношению к предыдущему разведению и т. д. Таким образом,, концентрация плазмы составляет: в I отверстии—100%, во II — 80%, в III — 64%, в IV — 51%, в V —41%, в VI—33%, в VII— 26%, в VIII —21%, в IX—17%,. в X—13%, в XI—11%, в XII — 9%. Результат учитывается после 12 часовой инкубации при 37° в термостате по наименьшей концентрации плазмы, которая вызывает лизис фибринового слоя. В исследовании применяется стандартная горячая денатурация фибриногена, которая приводит к инактивации адсорбированного на нем плазминогена. Таким образом, лизис на фибриновом агаре II типа может проявиться лишь в том случае, если плазминоген и активаторы содержатся в исследуемом материале.
Кровь от 8 нестажированных доноров консервировали на 2 растворах в разведении 4 : 1, на растворах ЦОЛИПК 7б и на том же растворе с добавлением 2500 ед. тцалола на 200 мл крови. Сразу после эксфузии в условиях стерильного бокса обе порции крови расфасовывали по 15 мл в пенциллиновые флаконы, герметично укупоривали и ставили в холодильник с температурой +4°. Исследования проводили в 1-й день консервации и на 7, 14,21 и 28-й дни. Перед опытом образцы крови на растворе ЦОЛИПК 7б и растворе ЦОЛИПК 7б + тцалол перемешивали и центрифугировали при 1 500 об/мин. в течение 10 мин. Полученную плазму разводили соответственно методике. Эксперимент проводили на I и II типе пленок. Таким образом, кровь каждого донора одномоментно исследовали на 4 фибриновых пленках (всего 160 пленок). Результаты исследования консервированной крови в процессе хранения представлены в таблице.
День хранения
| Статистические показатели
| Кровь, консервированная на растворах: | ||||||
ЦОЛИПК 7б | ЦОЛИПК 7б + тцалол | |||||||
|
|
|
|
|
| |||
ЕА | ІА | ІА | ЕА | IА | ІА | |||
|
| % | ЕА | % | ЕА | |||
| n= 8 |
|
|
|
|
|
| |
1-й | М | 17,7 | 78 | 6,8 | 20,5 | 83 | 6,0 | |
| m | 4,6 | 10,7 | 1,7 | 5,4 | 5,7 | 1,66 | |
| n=8
|
|
|
| 0,5 | 0,5 | 0,5. | |
7-й | М | 9,0 | 40 | 4,4 | 10,5 | 61 | 6,4 | |
| m | 0 | 5,8 | 0,62 | 1,0 | 2,2 | 0,49 | |
| Р n= 8 |
|
|
| 0,15 | 0,002 | 0,5 | |
14-й | М | 9,0 | 34 | 3,8 | 10 | 60 | 6,4 | |
| m | 0 | 3,7 | 0,4 | 0,47 | 10,0 | 0,89- | |
| Р n = 8 |
|
| 0,5 | 0,02 | 0,01 | ||
| ||||||||
21-й | М | 9,0 | 20,7 | 2,3 | 10 | 40,7 | 4,7 | |
| m | 0 | 2,8 | 0,3 | 0,83 | 7,3 | 0,8 | |
|
Р n=8 n = 8 |
|
| 0,24 | 0,02 | 0,05 | ||
| ||||||||
28-й | M | 9,0 | 16,0 | 1,9 | 9,0 | 32 | 3,6 | |
| m | 0 | 1,9 | 0,22 | 0 | 4,9 | 0,54 | |
| Р |
|
| 0,5 | 0,005 | 0,001 | ||
| Р1 | 0,07 | 0,001 | 0,01 | 0,005 | 0,001 | 0,18 |
Р — достоверность различий между кровью, консервированной на растворе ЦОЛИПК 76 и кровью, консервированной на растворе ЦОЛИПК 7б + тцалол;.P1— достоверность различий между показателями активности фибринолиза между 1-м и 28-м днями хранения.
Анализ данных, приведенных в таблице, показывает, что в процессе 4-недельного хранения консервированной глюкозоцитратной крови (на растворе ЦОЛИПК 7б ) наблюдается активация процессов фибринолиза. Снижение показателя внешней активации ЕА с 17,7 до 9,0% свидетельствует о некотором увеличении концентрации плазминогена. Особенно выражено усиление действия внутренних активаторов фибринолиза. Если в 1-й день исследования циркулярный лизис наблюдался при конечной концентрации плазмы в 78%, то к концу 4-й недели хранения лизис отмечался при значительном разведении плазмы (16% плазмы в буферном растворе). Соотношение внутренних активаторов и плазминогена ІА/ЕА также имеет тенденцию к уменьшению (с 6,8 до 1,9%), что указывает на усиление фибринолитической активности за счет действия внутренних активаторов исследуемой плазмы. При использовании для консервации крови раствора с тцалолом активация фибринолиза менее выражена. Снижение показателя ІА/ЕА за 4 недели хранения с 6,0 до 3,6% статистически не достоверно (Р1=0,18). ЕА изменяется с 20,5 до 9,0% — аналогично изменениям в крови без добавки тцалола, что объясняется, по всей вероятности, избыточной дозировкой стрептазы в наших опытах. ІА в крови с тцалолом снижается с 83 до 32%, тогда как в крови без тцалола — с 78 до 16%. Это свидетельствуете том, что хотя собственные внутренние активаторы фибринолиза полностью не ингибируются тцалолом, их действие в значительной степени ослаблено. Показано также, что в свежеконсервированной крови добавка тцалола не влияет на фибринолитическую активность. Различия по всем показателям статистически не достоверны (Р=0,5). К концу 1-й недели хранения в крови с тцалолом происходит заметная ингибиция внутренних активаторов фибринолиза (ІА=61 % против 40% в крови без тцалола), которая отчетливо выявляется во все последующие сроки наблюдения.
ВЫВОДЫ
- Для изучения динамики процесса фибринолиза целесообразно применение метода Вольфа.
- При хранении консервированной глюкозо-цитратной крови отмечается активация фибринолиза, особенно к 24-му дню.
- Добавление тцалола в состав консервирующего раствора замедляет развитие фибринолиза в крови при ее хранении.
About the authors
I. K. Slobojankina
Leningrad Research Institute of Geological and Biological Problems
Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Blood coagulation laboratory
Russian FederationU. L. Cazadze
Leningrad Research Institute of Geological and Biological Problems
Email: info@eco-vector.com
Blood coagulation laboratory
Russian Federation