About fibrinolytic processes in preserved blood

Abstract

Numerous studies have shown that blood loses its coagulation properties during long-term storage [1, 2, etc.]. However, the mechanism of these changes is not well understood. Along with the consumption of procoagulants during partial blood clotting during storage, a decrease in the activity of coagulation factors can be explained by the activation of fibrinolysis [3].

Full Text

Многочисленными исследованиями показано, что кровь при длительном хранении теряет свои коагуляционные свойства [1, 2 и др.]. Однако механизм этих изменений выяснен недостаточно. Наряду с потреблением прокоагулянтов при частичном свертывании крови в процессе хранения снижение активности факторов свертывания может быть объяснено активацией фибринолиза [3].

Для изучения компонентов фибринолитической системы, их изменений в процессе хранения консервированной крови нами был использован метод Вольфа с применением фибриновых пленок двух типов [3].

I тип пленок предназначается для изучения активности плазминогена, который, превращаясь в плазмин под влиянием внесенного в центральное отверстие активатора плазминогена (стрептаза, 50 ед.), дает зоны лизиса в виде дуг (рис. 1.).

II тип пленок позволяет рассчитать плазминовую активность, обусловленную взаи­модействием внутренних активаторов плазминогена исследуемого субстрата. При этом создаются оптимальные условия для внутренней активации плазминогена. Плазминовая активность индуцирует циркулярные зоны лизиса вокруг периферических отверстий. Центральное отверстие не используется (рис. 2).

Рис. 1 Активация плазминогена внешним активатором — стрептазой. В центральном отверстии — стрептаза. В периферических отверстиях (по часовой стрелке, с 1 по 12) разведенная плазма. ЕА, наименьшая концентрация плазмы, вызывающая лизис (11-е отверстие), со­ставляет 11%.

Рис. 2. Активация плазминогена внутренними активаторами. Центральное отверстие не используется. В перифери­ческих отверстиях (по часовой стрелке, с 1 по 12) разведенная плазма. ІА, наи­меньшая концентрация плазмы, вызы­вающая циркулярный лизис (4-е отвер­стие), составляет 51%.

Для I типа пленок Вольф предлагает термин ЕА (extrinsicactivator) — внешний активатор, характеризующий концентрацию плазминогена в исследуемом субстрате. Для результатов фибринолиза на II типе пленок применяется термин ІА (intrinsicactivator) — внутренний активатор, определяющий плазминовую активность, обуслов­ленную действием внутренних активаторов на собственный плазминоген плазмы.

IA / EA = наименьшая концентрация плазмы на  II типе / наименьшая концентрация плазмы на I типе выражает соотношение внутренних активаторов плазминогена и плазминогенового потенциала. В том случае, если показатель ІА/ЕА увеличивается в динамике иссле­дования, можно считать, что в плазме увеличивается концентрация плазминогена. Сни­жение показателя говорит об увеличении содержания внутренних активаторов фибри­нолиза. В норме IА/ЕА=3—14.

Приготовление фибринагаровых пластинок

I тип пленок. Реактивы: 1) буферный раствор с pH 8,5—хлористый натрий 8,5 г; 1,5 г двузамещенного фосфорнокислого калия, мертиолат 1:1000, дистиллированная вода до 800 мл. pH полученного раствора довести до 8,5 1 н. NaOH, долить дистилли­рованной водой до 1 л; 2) агар-агар 1%: 1 г агар-агара заливают на сутки дистил­лированной водой, которую меняют несколько раз. Воду сливают, добавляют к агар- агару 100 мл буферного раствора с pH 8,5 и кипятят в водяной бане до полного расплавления; 3) фибриноген 2%: 200 мг сухого фибриногена растворяют в 10 мл буфера с pH 8,5.Фибрин-агаровые пленки: в горячую баню (водяную) помещают цилиндр на 50 мл, в него вводят 13 мл расплавленного агар-агара и при температуре внутри цилиндра 70° добавляют 0,7 мл 2% раствора фибриногена. Полученную смесь перемешивают тер­мометром в течение 15 мин. при постоянной температуре. Как только раствор фибриногена приходит в контакт с горячим агар-агаром, образуется суспензия однородной, мутности. После инкубации фибрин-агаровую смесь разливают в стерильные чашки Петри (8х8) по 6,5 мл. Оставляют при комнатной температуре для застывания.

II тип пленок. Реактивы: 1) буферный раствор с pH 8,5; уксуснокислый аммоний 3,08 г; мертиолат 1:1000; дистиллированная вода до 800 мл. В полученном растворе доводят pH до 8,5 1 н. NaOH, доливают дистиллированной водой до 1 л. Остальные ингредиенты готовят так же, как для 1 типа пленок.

Для проведения исследований на фибриновых пленках обоих типов металличе­скими резцами делают 12 периферических отверстий, расположенных по 6 вокруг двух центральных. Диаметр центрального отверстия — 8 мм, периферического — 4 мм. Ми­нимальное расстояние между центральным и периферическим отверстием — 7 мм. В периферические отверстия вносят стерильной пипеткой 0,05 мл исследуемой плазмы, разведенной соответственно буфером для I и II типа пленок. В первое перифериче­ское отверстие помещают 0,05 мл цельной плазмы, во второе — 0,05 мл плазмы, разве­денной 4:1 буфером по отношению к предыдущему разведению и т. д. Таким образом,, концентрация плазмы составляет: в I отверстии—100%, во II — 80%, в III — 64%, в IV — 51%, в V —41%, в VI—33%, в VII— 26%, в VIII —21%, в IX—17%,. в X—13%, в XI—11%, в XII — 9%. Результат учитывается после 12 часовой инкуба­ции при 37° в термостате по наименьшей концентрации плазмы, которая вызывает лизис фибринового слоя. В исследовании применяется стандартная горячая денатура­ция фибриногена, которая приводит к инактивации адсорбированного на нем плазми­ногена. Таким образом, лизис на фибриновом агаре II типа может проявиться лишь в том случае, если плазминоген и активаторы содержатся в исследуемом материале.

Кровь от 8 нестажированных доноров консервировали на 2 растворах в разведении 4 : 1, на растворах ЦОЛИПК 7^б и на том же растворе с добавлением 2500 ед. тцалола на 200 мл крови. Сразу после эксфузии в условиях стерильного бокса обе порции крови расфасовывали по 15 мл в пенциллиновые флаконы, герметично укупоривали и ста­вили в холодильник с температурой +4°. Исследования проводили в 1-й день консер­вации и на 7, 14,21 и 28-й дни. Перед опытом образцы крови на растворе ЦОЛИПК 7^б и растворе ЦОЛИПК 7^б + тцалол перемешивали и центрифугировали при 1 500 об/мин. в течение 10 мин. Полученную плазму разводили соответственно методике. Экспери­мент проводили на I и II типе пленок. Таким образом, кровь каждого донора одномо­ментно исследовали на 4 фибриновых пленках (всего 160 пленок). Результаты иссле­дования консервированной крови в процессе хранения представлены в таблице.

День хранения	Статистические показа­тели	Кровь, консервированная на растворах:
		ЦОЛИПК 7б			ЦОЛИПК 7б + тцалол
		ЕА	ІА	ІА	ЕА	IА	ІА
		%		ЕА	%		ЕА
	n= 8
1-й	М	17,7	78	6,8	20,5	83	6,0
	m	4,6	10,7	1,7	5,4	5,7	1,66
	n=8				0,5	0,5	0,5.
7-й	М	9,0	40	4,4	10,5	61	6,4
	m	0	5,8	0,62	1,0	2,2	0,49
	Р n= 8				0,15	0,002	0,5
14-й	М	9,0	34	3,8	10	60	6,4
	m	0	3,7	0,4	0,47	10,0	0,89-
	Р n = 8				0,5	0,02	0,01
21-й	М	9,0	20,7	2,3	10	40,7	4,7
	m	0	2,8	0,3	0,83	7,3	0,8
	Р                 n=8 n = 8				0,24	0,02	0,05
28-й	M	9,0	16,0	1,9	9,0	32	3,6
	m	0	1,9	0,22	0	4,9	0,54
	Р				0,5	0,005	0,001
	Р1	0,07	0,001	0,01	0,005	0,001	0,18

Р — достоверность различий между кровью, консервированной на растворе ЦОЛИПК 7⁶ и кровью, консервированной на растворе ЦОЛИПК 7^б + тцалол;.P1— достоверность различий между показателями активности фибринолиза между 1-м и 28-м днями хранения.

Анализ данных, приведенных в таблице, показывает, что в процессе 4-недельного хранения консервированной глюкозоцитратной крови (на растворе ЦОЛИПК 7^б ) наблюдается активация процессов фибринолиза. Снижение показателя внешней акти­вации ЕА с 17,7 до 9,0% свидетельствует о некотором увеличении концентрации плазмино­гена. Особенно выражено усиление действия внутренних активаторов фибринолиза. Если в 1-й день исследования циркулярный лизис наблюдался при конечной концентрации плаз­мы в 78%, то к концу 4-й недели хранения лизис отмечался при значительном разведении плазмы (16% плазмы в буферном растворе). Соотношение внутренних активаторов и плаз­миногена ІА/ЕА также имеет тенденцию к уменьшению (с 6,8 до 1,9%), что указывает на усиление фибринолитической активности за счет действия внутренних активаторов иссле­дуемой плазмы. При использовании для консервации крови раствора с тцалолом актива­ция фибринолиза менее выражена. Снижение показателя ІА/ЕА за 4 недели хранения с 6,0 до 3,6% статистически не достоверно (Р1=0,18). ЕА изменяется с 20,5 до 9,0% — аналогично изменениям в крови без добавки тцалола, что объясняется, по всей вероят­ности, избыточной дозировкой стрептазы в наших опытах. ІА в крови с тцалолом снижа­ется с 83 до 32%, тогда как в крови без тцалола — с 78 до 16%. Это свидетельствуете том, что хотя собственные внутренние активаторы фибринолиза полностью не ингиби­руются тцалолом, их действие в значительной степени ослаблено. Показано также, что в свежеконсервированной крови добавка тцалола не влияет на фибринолитическую активность. Различия по всем показателям статистически не достоверны (Р=0,5). К концу 1-й недели хранения в крови с тцалолом происходит заметная ингибиция вну­тренних активаторов фибринолиза (ІА=61 % против 40% в крови без тцалола), кото­рая отчетливо выявляется во все последующие сроки наблюдения.

ВЫВОДЫ

1. Для изучения динамики процесса фибринолиза целесообразно применение мето­да Вольфа.
2. При хранении консервированной глюкозо-цитратной крови отмечается акти­вация фибринолиза, особенно к 24-му дню.
3. Добавление тцалола в состав консервирующего раствора замедляет развитие фибринолиза в крови при ее хранении.