New nutrient medium for the isolation of pertussis pathogene
- Authors: Amerkhanova N.N.1, Savinova A.N.1
-
Affiliations:
- Kazan State Medical University
- Issue: Vol 76, No 6 (1995)
- Pages: 456-457
- Section: New methods and rationalization proposals
- URL: https://kazanmedjournal.ru/kazanmedj/article/view/90625
- DOI: https://doi.org/10.17816/kazmj90625
- ID: 90625
Cite item
Full Text
Abstract
Three variants of nutrient medium for the isolation of B. pertussis are developed, where the commercial medium N 199 (Parker) is the basis. The comparative study of the quality of the developed variants of the nutrient medium and the casein-coal agar medium of Dagestan production and the casein-coal agar medium of Moscow production shows that the new nutrient media do better than the casein-coal agar medium of Dagestan as well as the casein-coal agar medium of Moscow, porticu- larly effective is the 3 variant.
Keywords
Full Text
Плановая вакцинопрофилактика коклюша, проводимая в нашей стране с 1959 г., значительно снизила заболеваемость и смертность от пего во многих регионах. Однако с 80-х г. наблюдается рост частоты данного заболевания, что обусловлено в основном накоплением значительного числа непривитых детей [6, 8, 9]. Так, в 1992—1993 гг. заболеваемость в Республике Татарстан составляла соответственно 23,2 и 30,6, в Российской Федерации—16,2 и 26,5 на 100 тыс. населения. Рост заболеваемости коклюшем регистрируется также во всем мире.
Существенные изменения за годы специфической профилактики произошли и в клинике коклюшной инфекции: участились случаи легких и стертых форм, затрудняющих клиническую диагностику данного заболевания [1, 7]. В связи с этим возросла роль микро-, биологических методов диагностики, в частности бактериологического. Однако последний мало чувствителен из-за позднего проведения исследований и плохого качества коммерческой питательной среды — казеиново-угольного агара (КУА).
Основным условием для успешной бактериологической диагностики коклюша является качество питательной среды. Широко используемые питательные среды /для выделения бордетелл нестандартны, имеют ряд недостатков и не обеспечивают высокую высеваемость возбудителя из материала от больных и лиц, контактировавших с ними. Поэтому целью наших исследований являлась разработка новой питательной среды, удовлетворяющей физиологические потребности бордетелл и обеспечивающей наиболее полное удаление ингибиторов роста коклюшных микробов.
Известно, что возбудитель коклюша требует для поддержания роста определенный набор аминокислот: цистеина, пролина, метионина, серина, глютамина, глицина, аланина, никотиновой кислоты, аспарагина, а также наличия в среде различных солей — железистых, магниевых, хлоридов, фосфатов и факторов роста. Исходя из этого, в качестве основы для питательной среды нами была выбрана коммерческая среда № 199 (Паркера), содержащая все необходимые для роста В. pertussis аминокислоты, соли и витамины. Кроме того, из данных литературы известно, что на этой среде хорошо растут микробы, требовательные к питательным средам: менингококк и др. [3]
Для подбора оптимального сорбента к плотному варианту питательной среды № 199 с 3—4% агара с pH 7,2—7,4 добавляли различные дозы латекса (от 0,05 до 2%), силикагеля (от 0,05 до 2,5%), крахмала (0,5—1,5 г/л), активированный уголь в концентрации 3 г/л, как и в среде КУА. Посевы эталонных штаммов коклюшных бактерий №№ 3747, 353, 475, 305 и 251 на питательные среды производили методом «капли». Посевная доза составляла 5X108 микробных клеток в объеме 0,1 мл. Посевы помещали в термостат при 37°С в условиях повышенной влажности и выдерживали их в течение 5 суток. Результаты регистрировали через 24, 48, 96 и 120 часов. Исследования показали, что на данных вариантах питательной среды коклюшные бактерии не росли.
В следующих сериях опытов для обогащения среды питательными веществами к агаризованной среде № 199, содержащей уголь или другие сорбенты, добавляли 10% крови кролика, нуклейнат натрия (4 мг/мл и 12 мг/мл), нуклейнат натрия и дрожжевой экстракт (от 0,15% до 0,9%), витамины группы В в качестве факторов роста: рибофлавин в дозах от 0,2 до 1,6 мг и тиамина бромид в тех же дозах. Однако и на этих вариантах питательной среды роста бордетелл не наблюдалось. Было предположено, что отсутствие роста исследуемых культур связано с недостаточным количеством аминного азота в составе среды № 199. Для оптимального роста коклюшных бактерий из данных литературы в питательной среде должно быть 170—180 мг% аминного азота. В связи с этим было определено его содержание в среде № 199. Оно оказалось равным 1,14 мг%. В следующих сериях опытов для повышения содержания аминного азота в составе среды № 199 были использованы гидролизат крови (отходы гамма-глобулинового производства после сепарирования крови и отделения сыворотки или плазмы) и аминопептид, препарат, получаемый путем ферментативного гидролиза белков крови крупного рогатого скота [2]. В качестве сорбента в среду вносили ионообменную смолу АВ-17 [4].
Было приготовлено 3 варианта среды. 1-й вариант содержал в качестве источника аминного азота гидролизат крови, добавляемый в агаризованную среду № 199 в соотношении 1 : 2; смолу. АВ-17 вносили в среду из расчета 1% перед автоклавированием при 0,5 атм в течение 30 минут. Во 2-м варианте в агаризованную среду № 199, кроме гидролизата крови, добавляли аминопептид (90 мл на 100 мл среды). Сорбентом служила ионообменная ДЛ смола АВ-17 в том же количестве, что и в первом варианте. 3-й вариант включал те же компоненты, что и 2-й вариант, но в более высокой концентрации: на 100 мл агаризовэнной питательной среды № 199 вносили 100 мл гидролизата крови и 100 мл аминопептида и добавляли 2% сорбента. Данная среда отличалась тем, что ее агаризацию производили питательным агаром, содержавшим ферментативный гидролизат кормовых дрожжей и хлорид натрия. Во все три варианта среды для ее затемнения вносили 0,1% активированного угля. Качество новых вариантов питательной среды сравнивали со средами КУАД, выпускаемой Дагестанским НИИ по производству питательных сред, и КУАД! (МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского), широко используемых в практике здравоохранения (табл. 1, 2).
Таблица 1
Сравнительная характеристика эффективности разработанных питательных сред для выделения В. pertussis
Среды | Количество опытов | Среднее количество колоний | |
посевная доза = 1000 м. т. | посевная доза = 500 м. т. | ||
Вариант 1 | 4 | 26,00±1,52 | 14,50±2,52 |
Вариант 2 | 4 | 25,75±1,70 | 12,50±1,91 |
Вариант 3 | 4 | 33,25±3,30 | 24,25±2,49 |
КУАМ | 4 | 9,56±1,29 | 3,50±0,57 |
КУАД | 4 | 3,33±0,96 | 0,33±0,08 |
Таблица 2
Кратность различий средних величин количеств выросших колоний В. pertussis на различных питательных средах
Сравниваемые варианты сред | Посевная доза (м. Т./0.1 мл) | |
1000 | 500 | |
КУАД-1 | 7,8 | 19,3 |
КУАД-2 | 7,7 | 17,2 |
КУАД-3 | 9,9 | 32,6 |
КУАМ-1 | 2,7 | 4 0 |
КУАМ-2 | 2,7 | 3,4 |
КУАМ-3 | 3,5 | 6,7 |
КУАМ—КУАД | 2,9 | 4,9 |
Разработанные варианты сред существенно превышают по эффективности как КУАД, так и КУАМ. Наибольшей эффективностью обладал 3-й вариант среды, который в 3,5 (Р<0,05) и 9,9 раза (Р<0,05) соответственно превышал высеваемость коклюшных бактерий при посевной дозе, равной 1000 микробных тел (м. т.), по сравнению с вариантом среды КУАМ и КУАД и в 6,7 (Р<0,05) и 32,6 раза (Р<0,05) при посевной дозе в 500 микробных тел.
Выводы
- Разработаны три новые высокоэффективные полусинтетические питательные среды для выделения В. pertussis.
- Все вновь разработанные среды превосходят по высеваемости применяемую в практике здравоохранения среду КУА.
- Наиболее эффективной питательной средой является 3-й вариант полусинтетической среды.
About the authors
N. N. Amerkhanova
Kazan State Medical University
Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Department of Microbiology, assistant manager
Russian Federation, KazanA. N. Savinova
Kazan State Medical University
Email: info@eco-vector.com
Department of Microbiology
Russian Federation, KazanReferences
