On the cultivation of the spirochete Obermeiera.

Abstract

Currently, we know several types of human blood spirochetes. The best studied are the following four species: 1) spirochete Obermeier'a, or spir. recurrentis, the causative agent of European relapsing fever, discovered Obe g me ie th in 1873, 2) spiroch. Duttoni, the causative agent of the African form of relapsing fever, discovered by Ros S'OM and Mi1Pe'om, as well as Dutton'OM and Todd'oM in 1904, 3) spiroch. Kochi, discovered in 1905

Full Text

В настоящее время мы знаем несколько видов кровяных спирохет человека. Наилучше изученными являются следующие четыре вида: 1) спирохета Obermeier’a, или spir. recurrentis, возбудитель европейского возвратного тифа, открытая Obe г me ie т ом в 187 3 г., 2) spiroch. Duttoni, возбудитель африканской формы возвратного тифа, открытая Ros s’om и Мi1пе’ом, а также Dutton’OM и Todd’oM в 1904 г., 3) spiroch. Kochi, открытая в 1905 г. Косйом в Восточной Африке (при исследовании Leckenfiebcrerkrankungen), и, наконец, 4) spiroch. Nоvу. возбудитель американского возвратного тифа, открытая в 1906 году Norris’OM в Америке и подробно изученная Novy и Кпарром. Исследованиями целого ряда авторов (Novy и Knapp Fraenkel, Uhlengut и Haendel, Manteufel, Sc hellack, Strong и др.) установлено, что эти четыре вида спирохет несомненно отличаются друг от друга, как морфологически, так и в отношении реакций иммунитета, патогенности для лабораторных животных и пр. С другой стороны, несмотря на то, что о существовании спирохет мы знаем давно (родовое понятие „спирохеты “ установлено Ehrenbergoм в 1875 г.), многое остается нам в области учения о спирохетах неясным. Достаточно указать, хотя-бы на то, что остается нерешенными даже вопрос, к какому классу живых существ следует отнести спирохет,—к бактериям или протозоям. Многие кардинальные вопросы, касающиеся морфологии и истории развития спирохет, остаются также нерешенными или разрешаются различными исследователями по разному, часто даже противоположно. Таковы вопросы о продольном п поперечном делении спирохет, о существовании полового способа размножения, особых форм развития спирохет (Ruheformen, Dauerformen и т. п.). ‘Одной из главных причин такой неполноты наших сведений о спирохетах является, как мне кажется, то обстоятельство, что почти до самого последнего времени мы не умели получать культуры спи­рохет на искусственных питательных средах, вследствие чего были лишены возможности наблюдать и изучать жизнь спирохет при наи­более благоприятных для наблюдателя условиях чистой разводки: не могли по своему усмотрению изменять жизни спирохет в целях эксперимента для решения того или другого вопроса и т. д. Отсутствие же культур патогенных спирохет имело своим следствием недостаточность и неточность наших знаний о реакциях иммунитета при спирохетных заболеваниях у человека и животных.

К настоящему времени имеется уже большая литература, касающаяся вопроса о культивировании патогенных спирохет человека. гл. обр. spiroch. pallida. На изучение методики культивирования этой спирохеты было направлено внимание целого ряда лиц почти тотчас после открытия бледной спирохеты Schaudinn’OM и Hoffmann’oM. В результате многочисленных исследований различных авторов (Volpinon Fontano, Levaditi и Масfntosch’a, Miihlens’a, Шерешевского, Tomaschew- s кого, Szesci,-Sowade, Шапиро, Schmamine, Ркоса, Danilo Schitae, Nogouchi) мы все же не имеем и теперь надежного и верного способа культивирования spiroch. pal- lidae, хотя, несомненно, некоторым авторам, как, наир., Nоgouchi, удалось получить чистую культуру этой спирохеты. Однако метод Nogouchi в руках целого ряда других исследователей не дал положительного результата, и нужно признать, что исследования Nogouchi решили вопрос о возможности культивирования бледной спирохеты скорее принципиально чем с практической точки зрения.

Не лучше обстоит дело и с опытами культивирования spirochaee Obermeier’a. Ни одна из кровяных спирохет человека не была получена в культуре в собственном смысле слова до 1912 года. Опыты NovyпКпарра, DuvаГя и Тоdda, Nоггis‘a, Pappenheim'a и Flournoy, Levaditi, Шерешевского, Milftlensa и др. трактуют скорее о способах продолжительного сохранения спирохет в жизнеспособном состоянии, чем о способах действительного культивирования их на искусственных питательных средах. Nogouchi был первым, которому удалось получить в чистой культуре кровяные спирохеты человека, в том числе и spiroch; Obermeiera. Питательной средой, на которой No-go. исhi получил культуры спирохет Оbегmеiега, Косha,, Duttoni и Novy, служила асцитическая жидкость с кусочком свежей, стерильной ткани (почки нормального кролика). Нужно отметить, что. не всякая асцитическая жидкость является годной для. приготовления питательной среды. Указать признаки, которыми можно было-бы руководиться при выборе асцитической жидкости, очень трудно, или, просто говоря, нельзя. В конце концов вопрос о пригодности асцитической жидкости решает опыт посева. Исходным ма­териалом для посева служила кровь инфицированного животного (мыши или/ крысы). Техника приготовления культуры по Nogouchi следующая:

 В две стерильные пробирки (2 сайт, в диаметре и 20 сайт, высоты) опускаются кусочки свежей стерильной ткани.

• В каждую пробирку прибавляется по 10 капель спирохет содержащей крови.
• Затем туда же прибавляется 15 куб. сайт, асцитической жидкости.
• В одну из пробирок прибавляется 3 куб. сант. парафинного масла, в другую же масла не прибавляется.
• Пробирки Ставятся в термостат при 37 °C.

Необходимыми условиями для получения первой культуры и дальнейших генераций Nogouchi считает только вполне под­ходящую асцитическую жидкость и абсолютно свежий, стерильный кусочек ткани. Описанным путем Nogouchi получил в тече­ние 6 месяцев 29 генераций спирохеты Koch’a, которая культи­вируется легче всего, и только 9 генераций других спирохет. Ma­ximum роста спирохеты Obermeier’a и спирохеты Novy достигается на 7 или 8 день, спирохеты Dutton’a и Kocli'a —на 9 день. Спирохеты растут как в пробирках с парафинным маслом, так и без него.

На основании своих опытов с культивированием кровяных спирохет Nogouchi отмечает у этих спирохет некоторые особенности в смысле условий роста по сравнению с другими спирохетами (spiroch. pallida, pertennuis, microdentium, macrodentium, mucosa, refringens, phagadenica:—тогда как последние спирохеты растут только при строго-анаэробных условиях, кровяные спирохеты, наоборот, при абсолютном отсутствии кислорода не развиваются. Но, в то же время, эти спирохеты до известной степени являются анаэробами, т. к. требуют для своего роста прибавления к питательной среде кусочка свежей ткани. Поэтому Nоgоuсhi называет их аэротропными анаэробами.

Как видно из описания опытов Nоgоuсhi, питательная среда, предложенная им для культивирования спирохет, обладает очень крупным недостатком, ставящим подчас непреодолимые препятствия для ее приготовления. Этим недостатком являются ближе нам неизвестные свойства асцитической жидкости, которыми определяется пригодность ее для приготовления питательной среды. Исследования  Nоgоuсhi ясно показывают, что подходящую асцитическую жидкость не так легко иметь под руками. „Нечего удивляться тому", пишет этот автор, „что из 10 сортов асцитической жидкости различного происхождения только один окажется годным".

Приступая к изучению вопроса о культивировании спирохеты Obermeier'a, я делал посев крови (а также и сыворотки) больных возвратным тифом на среду Nоgоuсhi, но получил отрицательные результаты: через 12 часов после посева спирохеты были неподвижны и представляли ясные признаки разрушения. Правда, в моем распоряжении было всего 2 сорта асцитической жидкости, которые оба, следовательно, не обладали свойствами, определяющими их пригодность для культивирования спирохет.             

Шагом вперед в вопросе о культивировании кровяных спирохет человека, хотя и не Obermeiеговской, а африканской, является исследование Hata. Он удачно культивировал африканскую спирохету на разведенной полусвернутой (при 71 "С) лошадиной сыворотке с прибавлением или кусочка свежей ткани, или кровяного сгустка, получающегося при свертывании лошадиной крови. Эта среда является несравненно более доступной даже для небольшой бактериологической лаборатории, чем среда Nоgоuсhi, хотя имеет другое неудобство,—будучи полутвердой и неоднородной, эта среда не позволяет так легко и просто следить за морфологическими изменениями спирохет в культуре, как это можно делать в жидкой среде, из-за присутствия взвешенных в большом количестве кусочков свернувшегося белка. Но с этим недостатком можно бы было мириться, если-бы среда Hata давала положительный результат при посеве spiroch. Obermeier'a. Здесь, однако, дело не обстоит так просто, как это было в опытах Hata с африканской спирохетой. Из засеянных кровью рекуррентика 9 пробирок со средой Hata мне удалось через 48 часов видеть в одной только, пробирке увеличение количества спирохет, в остальных же пробирках не было никакого намека на удачный исход посева. Мало того, и в пробирке, где наблюдалось увеличение количества спирохет, через 72 часа спирохеты были уже неподвижны, и пересевы, сделанные черев 48 и 72 часа на новые питательные среды с целью получить вторую генерацию, остались безрезультатными. Вторая попытка- получить на среде Hata культуру спирохеты Оbегmеiеrа из крови другого больного была еще менее удачна: из засеянных 10 пробирок все остались стерильными. Т. о. я пришел к заключению, что среда Hata является непригодной для культивирования спирохет Obermeiera, а с другой стороны,— имея в виду неудовлетворительность методики Nogouchi, которая сводит попытки культивирования спирохет, в конце концов, к  счастливой случайности,—я предпринял ряд опытов с целью разработки верного и по возможности простого способа выращивать спирохету Obermeiera в пробирке на искусственной питательной среде.

В своих опытах я исходил из следующих соображений: раз спирохеты Obermeiera роскошно развиваются в крови больного человека, то,. казалось-бы, сыворотка человека должна содержать все необходимые питательные вещества для роста спирохет, процесс свертывания едва-ли может повести к исчезновению этих веществ из сыворотки. И если спирохета Obermeiera все же не дает культуры в пробирке на человеческой сыворотке, то причину этого обстоятельства нужно искать скорее не в недостатке питательных веществ, а в нашем незнании других условий роста спирохеты, которые она встречает, развиваясь в крови человека, или можно допустить, что в сыворотке, при наличности необходимого питательного материала, содержатся вещества, губительно действующие на спирохеты и образующиеся, быть может, в период свертывания крови. Исходя из этих соображений, я прежде всего старался изучить отношение спирохет к человеческой сыворотке и в скором времени убедился, что в зависимости от температуры, при которой содержится сыворотка со спирохетами, эти последние исчезают то быстро— в течение нескольких часов, при 37° С. то значительно медленнее —сохраняясь днями, а иногда и неделями при комнатной и более низкой температуре. При сохранении пробирок при комнатной температуре иногда в течение первых дней приходилось наблюдать даже некоторое увеличение количества- спирохет, но это явление непостоянно и зависит, невидимому, от периода болезни, в который берется кровь от больного человека. Быстрая гибель спирохет при температуре термостата и сохранение в жизнеспособном состоянии при низкой температуре едва-ли можно объяснить недостатком питательного материала, а скорее вяжется с представлением о наличности, в сыворотке человека какой-то вредно действующей субстанции, проявляющей свое действие при высокой температуре быстрее, чем при низкой. Задача, таким образом, сводится к тому, чтобы устранить губительное действие сыворотки. Известно, далее, что на различного рода цитолитические процессы задерживающее влияние оказывают посторонние сыворотки и в частности лошадиная сыворотка. Поэтому я приготовил ряд смесей, состоящих из человеческой и лошадиной сывороток и физиологического раствора хлористого натрия. При посеве крови больного возвратным тифом оказалось, что спирохеты несомненно растут и размножаются в смесях, где количество человеческой сыворотки не превышает 20% и при наличности лошадиной сыворотки 50% по отношению ко всей смеси. Наиболее обильной оказалась культура на среде следующего состава: 2 куб. сайт, свежей сыворотки человека, 6 куб. сант, свежей сыворотки лошади и 4 куб., сант. физиолог, раствора хлористого- ватрия. Вскоре, однако, я убедился, что человеческая сыворотка во все не является необходимой составной частью питательной среды,, и что спирохеты Obегmеiеrа дают культуру просто в смеси лошадиной сыворотки и физиологического раствора хлористого- натрия, при условии, чтобы сыворотка лошади была обязательно- свежей. Б смеси, состоящей из 4 куб. сант. лошадиной сыворотки и 8 куб. сант. раствора хлористого натрия, спирохеты несомненно размножаются, и на 4- 5 день после посева получается,—правда,, небогатая,—культура спирохет, из которой удается получить субкультуру на такой же питательной среде. При maximume роста удается видеть 5—6 спирохет в поле зрения, если рассматривать каплю жидкости под микроскопом (Paraboloid, condensor Leitz'a, Ob. Leitz’a 6, Ocul. 4).

He довольствуясь скудным ростом спирохет, я предпринял ряд. опытов с целью получить более богатую и обильную культуру. Принимая во внимание указания Nоgоuсhi а также исследования Hata, я стал прибавлять к смеси лошадиной сыворотки и физиолог. раствора хлорист. натрия кусочки ткани, кусочки кровяного сгустка из лошадиной и человеческой крови. Однако и при этих условиях богатой культуры иолучить мне не удалось, хотя должно заметить, что прибавление i питательной среде кусочков ткани или сгустка все же имеет благоприятное влияние на рост спирохет, особенно, если питательная среда приготовлена на лошадиной сыворотке, сохранявшейся некоторое время при низкой температуре.

Наряду с этим благоприятным влиянием пришлось наблюдать иногда явления противоположного характера,—когда рост спирохет был более обильным на первоначальной среде без прибавления кусочков ткани или сгустка. Я затрудняюсь указать причину этого явления, но, быть может, здесь дело идет о продуктах аутолитического распада, которые и оказывают вредное влияние на развитие культуры. Во всяком случае описанная модификация среды не дала желанных результатов и побуждала продолжать поиски дальше.

Как известно, Nоgоuсhi настаивает на том, что кусочек свежей стерильной ткани животного является крайне важной,. если не необходимой, составной частью питательной среды для спирохет; однако, если здесь дело идет только о создании условий анаэробиоза, то является возможным воспользоваться для этой цели и другими средствами. С другой стороны едва-ли позволительно совершенно исключить возможность еще и иных влияний на питательную среду со стороны свежей ткани. Быть может, будет более правильным сказать, что этих сложных влияний мы просто не знаем: туг необходимо учесть как чисто химические, так и физико-химические процессы, причем остается неясной роль ни тех, ни других, как остается неясным, где кроется благоприятное влияние и где начинается Губительное действие этих процессов на развитие спирохет. Поэтому естественным является¹ желание упростить дело, исключив по возможности некоторые из этих ближе неизвестных нам процессов.

Исходя из этих соображений, я прежде всего попробовал заменить „свежую" ткань и „свежий" кровяной сгусток более индифферентным с химической точки зрения веществом—свернутым белком куриного яйца. Куриное яйцо, лишь-бы оно не обладало явными признаками порчи, варится обычным образом ввод: „вкрутую", после чего белок тщательно отделяется от желтка и делится ножом на кусочки объемом в 1-2 куб. сайт., которые распределяются по пробиркам. Белка из одного куриного яйца достаточно для заполнения 12—15 пробирок. Затем в пробирки прибавляется по 8 куб. сайт, физиологического раствора хлористого натрия; в таком виде пробирки стерилизуются в автоклаве при 120º в течение 15 минут. Остается теперь добавить всюду по 4 куб. сайт, не нагретой лошадиной сыворотки, и среда готова для посева. На приготовленной таким образом питательной среде мне удалось получить с первого же раза очень богатую культуру спирох Obermeiera. Достаточно посеять 1—2 капли крови больного, чтобы через несколько дней при температуре 37°C. получить богатую культуру,—когда при рассматривании капли питательной среды пот микроскопом в поле зрения видно 30—40 спирохет, а иногда и больше. Генерации полученных из крови человека спирохет удаются легко, и в настоящее время я имею в лаборатории 19-ю генерацию первого штамма, выкультивированного из крови больного два месяца тому назад. Развитие культуры идет быстрее, чем это описывают Nogouchi и Hata. Обычно maximum роста достигается па 4—5 день. В культуре можно видеть формы спирохет, отличающиеся по длине и взаимному расположению: наряду с очень короткими спирохетами встречаются экземпляры, по крайней мере в 10 раз превышающие их по длине; большею частью спирохеты распо­лагаются отдельно одна от другой, но вместе с тем можно видеть и аггломерати спирохет, состоящие из 5—6 особей, образующих очень красивые фигуры звезд с расходящимися в разные стороны лучами; иногда можно бывает отметить, как две спирохеты, боль­шею частью длинные, перевиваются, переплетаются одна вокруг другой подлиннику; встречаются, наконец, фигуры, которые проще всего трактовать, как явление поперечного деления спирохет, и ко­торые характеризуются тем, что две спирохеты, большею нас­таю короткие и находящиеся в оживленном движении, со­единены между собою тоненьким, едва заметным мостиком, имею­щим вид очень нежной нити. Нужно отметить, что в зависимости от периода развития спирохет в культуре преобладают те или дру­гие формы. Длинные спирохеты, звездообразные фигуры и переви­вающиеся формы появляются в культуре в первые дни роста: на­оборот, для периода maximum'a роста является характерным как- бы наводнение культуры мелкими формами спирохет, прядающими картине однообразный вид. (См. прилагаемые рисунки).

По достижении maximum’a роста, обычно в течение следую­щих суток или даже быстрее, картина резко меняется: в течение этого времени от богатого населения культуры остаются лишь жал­кие остатки в виде отдельно плавающих в жидкости, большею частью неподвижных спирохет, и, лишь как исключение, можно из­редка встретить подвижные формы. Если же по достижении ma­ximum’a роста культуры переносятся из термостата в прохладное место и содержатся дальше при температуре 5—7°C., то при та­ких условиях спирохеты сохраняются в жизнеспособном состоянии

Приложение к статье В. М. Аристовского.

По культировании спирохеты Obermeier’a“ Культура спирохеты Obermeier’a на среде с куриным белком.

Рис. 1. 24-х часовая культура.

Рис. 2. 2-х суточная культура.

Рис. 3. 3-х суточная культура.

Рис. 4. 4-х суточная культура.

очень продолжительное время. Я ещё не имею возможности точно указать продолжительность сохранения культур в жизнеспособном со­стоянии, так как этот вопрос систематически мною не разработан до настоящего времени; однако имеются уже наблюдения, что в сохра­няемых в течение месяца при низкой температуре культурах спиро­хеты. хотя и уменьшаются в числе, но все же при рассматривании под микроскопом в каждом поле зрения можно видеть!—2 подвиж­ных спирохеты. Посевы из таких культур на новые питательные сре­ды всегда дают положительный результат, причем развитие культуры идет обычным порядком. Ясно, что культуры спирохет при таких условиях могут сохраняться п более продолжительное время, чем один месяц, так как, несомненно, гибель спирохет в культуре про­исходит лишь очень медленно, если, спустя еще месяц, можно бы­вает видеть в каждом поле зрения 1—2 подвижных спирохеты.

Таким образом, предлагаемая мной методика выращивания в пробирках спирохеты Obermeier'a крайне проста и в то же время безусловно надёжна. Имея в руках верный метод получения богатых культур спирохеты, мы получаем в то же время возможность пересмотреть заново целый ряд вопросов, связанных с морфологией и биологией спирохет, а также вопросов иммунитета при возврат­ном тифе. В настоящее время мной приступлепо уже к получению иммунной сыворотки от кролика. Было-бы удобнее, конечно, поль­зоваться для иммунизации не кроликом, а лошадью, имея в виду состав питательной среды, куда входит, как составная часть, лоша­диная сыворотка, против белков которой будут также появляться противотела в случае иммунизации кролика. А это обстоятельство, конечно, может значительно осложнить дело и затемнить картину и без того сложных реакций иммунитета. Выход из этого положе­ния. однако, есть, и очень простой. Я заменил в своей питатель­ной среде сыворотку лошади инактивированной при 56°С. сыворот­кой кролика и получил при этом также богатую культуру спиро­хет. Для получения прививочного материала в настоящее время я пользуюсь средой следующего состава: физиолог, раствора хлорист. натрия 8 куб. сайт, инактивированной сыворотки кролика—2,5 куб. сайт, и кусочки свернутого белка из куриного яйца.

Наряду с этим мной делаются попытки подойти ближе к раз­решению вопросов, связанных с морфологией, историей развития и -физиологией спирохет вообще и спирохеты Оbегmеiега в частности.