Генотипирование групп крови эритроцитов для пациентов с множественными трансфузиями

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Цель. Оценить возможность применения молекулярно-генетического типирования эритроцитов у реципиентов, получавших трансфузии в течение 3 мес.

Методы. В исследование были включены образцы крови 95 пациентов, получивших 3 или более трансфузий эритроцитов в течение 3 мес. Пациенты имели следующие диагнозы: β-талассемия (n=4), апластическая анемия (n=5), множественная миелома (n=7), неходжкинские лимфомы (n=11), хронический миелолейкоз (n=16), первичный миелофиброз (n=9), миелодиспластический синдром (n=22), острый лейкоз (n=21). Фенотипирование антигенов эритроцитов проводили методом гемагглютинации в гелевых картах DiaClon Rh-Subgroups+K. Генотипирование Rh, Kell осуществляли с помощью наборов SSP-PCR RBC — FluoGene vERYfy (Inno-train Diagnostik, Германия). Проведено генотипирование стандартных аллелей RHD/RHCE, а также полиморфизмов, связанных с KEL1/KEL2 [T698C (Met198Thr)] гена KEL.Результаты серологического и молекулярно-генетического типирования групп крови RhCE и Kell у доноров совпадали на 100%, в то время как в исследуемых образцах крови пациентов расхождение составило 45,3%. Расхождения по антигенам системы Rh зарегистрированы у 41 больного: по одному антигену системы Rh — у 30 пациентов, по двум — у 9 человек. 10 пациентов, фенотип которых определялся как RhCc, были генотипированы как RHCE*CC. 2 пациента, которые были фенотипированы как Rhee, имели генотип RHCE*EE. У 2 человек антигены D и C не выявлялись в фенотипе, но были обнаружены в генотипе. Расхождения по антигену K зафиксировано у 2 пациентов, причём антиген отсутствовал в фенотипе, но присутствовал в генотипе. Результаты генотипирования были подтверждены серологическим исследованием при последующих госпитализациях.

Вывод. Генотипирование служит полезным дополнением к традиционным методам в тех случаях, когда серологическое типирование ограничено.

Полный текст

Актуальность. Проведение гемокомпонентной терапии пациентам с гемобластозами и депрессиями кроветворения часто осложнено наличием в кровотоке реципиента популяции донорских эритроцитов от предыдущей трансфузии (трансфузионный химеризм), что не позволяет проводить точное фенотипирование групп крови, если тестирование не было выполнено до начала трансфузий. Трансфузии компонентов донорской крови, несущих отсутствующие у реципиента антигены, повышают риск аллоиммунизации. Формирование клинически значимых аллоантител повышает риск развития посттрансфузионных реакций гемолитического типа при последующей трансфузии. Наличие у реципиентов аллоантител ещё больше задерживает процесс поиска совместимых единиц эритроцитов, которые не несут соответствующие антигены. Кроме того, аллоиммунизация сокращает выживаемость перелитых эритроцитов и увеличивает потребность в трансфузиях, которые в конечном итоге повышают нагрузку железом на организм [1–7].

Уровень аллоиммунизации у гематологических больных по разным данным составляет от 1,0 до 3,2%, а у больных серповидноклеточной анемией может достигать 43%. Наиболее ­часто встречаются антитела против антигенов систем Rh и Kell. Несмотря на то обстоятельство, что переливание идентичных по фенотипу Rh и Kell, в дополнение к AB0 и RhD, гемокомпонентов значительно снизило частоту аллоиммунизации, этот риск не был полностью устранён в случае множественных трансфузий [8–11].

За последнее десятилетие ряд исследователей указали на преимущества генотипирования группы крови для таких больных, так как между фенотипированием и генотипированием часто обнаруживают несоответствия [12–14].

Цель. Оценить возможность применения молекулярно-генетического типирования генов эритроцитов у реципиентов, получавших трансфузии в течение 3 мес.

Материал и методы исследования. В исследование были включены образцы крови 95 пациентов, проходивших лечение в ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства» (РосНИИГТ ФМБА). Все пациенты получили 3 и/или более трансфузий эритроцитов в течение 3 мес. Всеми участниками было подписано информированное согласие на участие в исследовании и согласие на забор крови.

На проведение исследования было получено разрешение локального этического комитета ФГБУ РосНИИГТ ФМБА (протокол №40 от 13 мая 2021 г.).

Пациенты имели следующие диагнозы: β-талассемия (n=4), апластическая анемия (n=5), множественная миелома (n=7), неходжкинские лимфомы (n=11), хронический миелолейкоз (n=16), первичный миелофиброз (n=9), миелодиспластический синдром (n=22), острый лейкоз (n=21). Фенотипирование проводили методом гемагглютинации в гелевых картах DiaClon Rh-Subgroups+K в соответствии с инструкциями производителя (BIO-RAD, Швейцария).

Геномная дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) была получена с помощью набора реагентов ДНК-сорб-В (Россия) из 9 мл периферической венозной крови, взятой в поли­этиленовые пробирки, содержащие 1 мл 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты. Процесс выделения ДНК осуществляли согласно инструкции производителя. Концентрацию ДНК в каждом образце определяли с помощью измерений оптической плотности при 260 и 280 нм. Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали 50–100 нг ДНК.

Генотипирование Rh, Kell проводили с помощью наборов SSP-PCR RBC — FluoGene vERYfy (Inno-train Diagnostik, Германия). Наборы состоят из ПЦР-планшетов с ячейками, содержащими предварительно помещённые в них и высушенные реакционные смеси, содержащие аллель-специфические праймеры, праймеры внутреннего контроля и нуклеотиды. Мастер-микс был приготовлен из 10Х ПЦР-буфера, раствора ДНК, Taq-полимеразы и дистиллированной воды. Параметры амплификации были использованы в соответствии с инструкцией производителя. Продукты амплификации были оценены с помощью программного обеспечения FluoVista. Проведено молекулярно-генетическое типирование стандартных аллелей RHD/RHCE и аллеля CW, а также полиморфизмов, связанных с KEL1/KEL2 [T698C (Met198Thr)] гена KEL.

Результаты и обсуждение. Сравнение результатов серологического и молекулярно-­генетического типирования групп крови RhCE и Kell показало, что среди доноров крови и её компонентов результаты совпадали на 100% (10/10), в то время как в исследуемых образцах крови ранее наблюдавшихся в учреждении пациентов отмечены расхождения (табл. 1).

 

Таблица 1. Результаты серологического и молекулярно-генетического типирования групп крови больных, получивших 3 и/или более трансфузий эритроцитов в течение 3 мес

Обследовано больных, n

Соответствие фенотипа генотипу, n (%)

Несоответствие фенотипа ­генотипу, n (%)

95

52 (54,7%)

43 (45,3%)

 

Так, расхождения по антигенам системы Rh и Kell зарегистрированы у 43 больных (табл. 2).

 

Таблица 2. Расхождения результатов серологического и молекулярно-генетического типирования групп крови RhCE и Kell у больных

Система антигенов

Антиген, по которому выявлено расхождение

Число больных с расхождением по антигенам, n (%)

Фенотип, n

Генотип, n

Rh

C

11 (11,5)

Cх*cEe (7)

ccEe (7)

Cх*cee (1)

ccee (1)

Cх*cEE (3)

ccEE (3)

E

9 (9,5)

CcEх*e (5)

Ccee (5)

CCEх*e (4)

CCee (4)

c

9 (9,5)

Ccх*ee (4)

CCee (4)

Ccх*Ee (5)

CCEe (5)

cE

4 (4,2)

Ccх*Eх*e (4)

CCee (4)

e

3 (3,2)

CcEeх* (1)

CcEE (1)

ccEeх* (2)

ccEE (2)

Ce

2 (2,1)

Cх*cEeх* (2)

ccEE (2)

CE

1 (1,1)

Cх*cEх*e (1)

ccee (1)

DC

2 (2,1)

ccdee (2)

CcDee (2)

Kell

K

2 (2,1)

CcEeK– (2)

CcEeK+ (2)

Примечание: х (химера) — двойная популяция эритроцитов.

 

Расхождение по одному антигену системы Rh выявлено у 30 пациентов, по двум антигенам — у 9 человек. Результаты обследования 39 пациентов показали трансфузионный химеризм: наличие антигенов С, c, E, e в фенотипе и отсутствие в генотипе, что свидетельствует о трансфузиях неидентичных по антигенам системы Rh гемокомпонентов.

Обращает на себя внимание высокая частота несоответствия по антигену с, который обладает высокой иммуногенностью. 10 пациентов, фенотип которых определялся как RhCc, были генотипированы как RHCE*CC, что приводило к необходимости поиска c-отрицательных единиц эритроцитов. У таких пациентов высока ­вероятность аллоиммунизации.

Аналогично 2 пациента, которые были фенотипированы как Rhee, имели генотип RHCE*EE, что требовало поиска е-отрицательных единиц эритроцитов. У 2 человек антигены D и C не выявлены в фенотипе, но определились в генотипе. Данные пациенты страдали хроническим миелолейкозом и миелодиспластическим синдромом, и отсутствие в фенотипе указанных антигенов свидетельствовало о потере экспрессии антигенов эритроцитами. У 1 пациента потеря экспрессии носила кратковременный характер и восстановилась после терапии. У второго, ранее наблюдавшего пациента потеря экспрессии была связана с развитием терминального рецидива с последующим летальным исходом.

Расхождения по антигену K зафиксировано у 2 пациентов, причём антиген отсутствовал в фенотипе, но присутствовал в генотипе. Полученные расхождения связаны с высокой трансфузионной активностью (18 и 22 дозы эритроцитной взвеси соответственно) у пациентов, получавших трансфузии эритроцитных компонентов, не содержащих антиген K системы Kell.

Все последующие трансфузии компонентов крови пациенты получали с учётом генотипа системы Rh. В результате трансфузий гемолитических реакций и осложнений зафиксировано не было. Результаты молекулярно-­генетического типирования были подтверждены серологическим исследованием при последующих госпитализациях.

Наши данные показали высокую согласованность результатов между двумя методами исследования для доноров крови (100%). Однако, как и ожидалось, в группе пациентов зарегистрированы многочисленные противоречивые результаты для RhCE и Kell.

Полученные нами данные согласуются с результатами других исследований, в которых расхождения между результатами генотипирования и фенотипирования колебались от 10 до 90% у пациентов, получавших трансфузии компонентов крови [14–16]. Так, в 1999 г. T.G. Legler и соавт. оценили применение молекулярно-генетических методов типирования групп крови системы Rh у трансфузионно-зависимых больных. В 2 из 27 случаев фенотипически D-негативные пациенты по результатам генотипирования оказались D-позитивными; у 4 пациентов с фенотипом RhCc генотип определили как СС; у 1 пациента с фенотипом Rhее — генотип Ee [17].

Позднее, в 2013 г., другая группа исследователей также провела сравнительный анализ генотипирования и фенотипирования антигенов эритроцитов систем Rh и K у больных, нуждающихся в постоянных пожизненных трансфузиях [7]. У 51% обследованных пациентов были выявлены расхождения, которые могли стать причиной синтеза аллоиммунных антител. Так, у 5 пациентов с фенотипом RhCc был определён генотип СС, а у 2 пациентов с фенотипом Rhее был установлен генотип ЕЕ. Также у 2 человек, в фенотипе которых антиген K не был выявлен, генотип определили как Kk, что расширило поиск совместимых донорских гемокомпонентов. Авторы подчёркивают, что молекулярно-генетическое типирование является необходимым стандартом для трансфузионно-зависимых пациентов [7].

В то же время, молекулярно-генетические методы типирования достаточно сложны и дороги для рутинной практики, поэтому нереалистично предполагать, что донорские центры смогут обеспечить всех реципиентов совместимыми по трансфузионно важным антигенам компонентами донорской крови.

Тем не менее, расширенное типирование методами на основе ПЦР компонентов донорской крови для аллоиммунизированных реципиентов и пациентов с такими заболеваниями, как серповидноклеточная анемия и талассемия, широко применяют в рутинной практике [3, 18, 19]. Однако, несмотря на значимость молекулярно-генетических методов типирования, эти методы не заменят серологических методов. Сохранят свою актуальность и серологические методы скрининга и идентификации антиэритроцитарных аллоантител [1, 2]. Выбор методики будет зависеть от лечебного профиля и задач конкретной службы здравоохранения. Применение молекулярно-генетических методов типирования групп крови в дополнение к серологическим станет ещё одним этапом совершенствования системы обеспечения иммунологической безопасности гемотрансфузионной терапии.

Выводы

  1. Показана возможность применения молекулярно-генетического типирования эритроцитов у доноров крови и реципиентов с трансфузионным химеризмом.
  2. Расхождения результатов серологического и молекулярно-генетического типирования групп крови RhCE и Kell в образцах крови пациентов, получивших 3 и/или более трансфузий эритроцитов в течение 3 мес, зарегистрированы в 45,3% случаев.
  3. Молекулярное типирование позволяет получить достоверный результат в тех случаях, когда интерпретация результатов серологического типирования затруднена.

 

Участие авторов. Н.В.М. — руководитель проекта, формулировка концепции работы, написание текста; С.В.Г., Е.А.С. и Н.Н.Б. проводили исследование; И.И.К. и С.С.Б. — сбор и анализ результатов, их интерпретация, написание текста; А.В.Ч. и С.С.Б. осуществляли консультирование по клиническим вопросам, окончательное одобрение рукописи.
Источник финансирования. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

×

Об авторах

Наталья Витальевна Минеева

Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства

Email: izoserologia@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7137-8877
Россия, г. Санкт-Петербург, Россия

Ирина Ивановна Кробинец

Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства

Автор, ответственный за переписку.
Email: transfusion_spb@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6404-2387
Россия, г. Санкт-Петербург, Россия

Светлана Викторовна Гавровская

Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства

Email: izoserologia@mail.ru
Россия, г. Санкт-Петербург, Россия

Наталия Николаевна Бодрова

Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства

Email: izoserologia@mail.ru
Россия, г. Санкт-Петербург, Россия

Елена Анатольевна Сысоева

Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства

Email: izoserologia@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9465-4704
Россия, г. Санкт-Петербург, Россия

Александр Викторович Чечеткин

Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства

Email: bloodscience@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7569-0697
Россия, г. Санкт-Петербург, Россия

Станислав Семенович Бессмельцев

Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства

Email: bessmeltsev@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7280-7100
Россия, г. Санкт-Петербург, Россия

Список литературы

  1. Anstee D.J. Red cell genotyping and future of pretransfusion testing. Blood. 2009; 114: 248–256. doi: 10.1182/blood-2008-11-146860.
  2. Reid M.E. Transfusion in the age of molecular diagnostics. Hematology. 2009; 14: 171–177. doi: 10.1182/asheducation-2009.1.171.
  3. Scharberg E.A., Richter E. Red cell antigen testing. ISBT Sci. Series. 2015; 10: 5–11. doi: 10.1111/voxs.12134.
  4. Nambiar R.K., Narayanan G., Prakash N.P., Vijaya­lakshmi K. Blood group change in acute myeloid leukemia. Proceedings (Baylor University. Medical Center). 2017; 30: 74–75. doi: 10.1080/08998280.2017.11929536.
  5. Chapuy C.I., Nicholson R.T., Aguad M.D., Chapuy B., Laubach J.P., Richardson P.G., Doshi P., Kaufman R.M. Resolving the daratumumab interference with blood compatibility testing. Transfusion. 2015; 55: 1545–1554. doi: 10.1111/trf.13069.
  6. Кробинец И.И., Минеева Н.В., Сысоева Е.А., Чечёткин А.В. Особенности интерпретации результатов исследований антигенов и антител АВ0 и Резус у пациентов с гематологическими заболеваниями. Сибирский науч. мед. ж. 2020; 40 (5): 66–72. doi: 10.15372/SSMJ20200507.
  7. Bakanay S.M., Ozturk A., Ileri T., Ince E., Yavasoglu S., Akar N., Uysal Z., Arslan O. Blood group genotyping in multi-transfused patients. Transfusion and Apheresis Sci. 2013; 48: 257–261. DOI: 110.1016/j.transci.2013.01.009.
  8. Бутина Е.В., Минеева Н.В., Зайцева Г.А., Попонина Е.А., Йовдий А.В. Аллоиммунизация к антигенам эритроцитов у пациентов с гематологическими и онкогематологическими заболеваниями. Трансфузиология. 2019; 21 (2): 27–34
  9. Wang L.Y., Liang D.C., Liu H.C., Chang F.C., Wang C.L., Chan Y.S., Lin M. Alloimmunization among patients with transfusion-dependent thalassemia in Taiwan. Transfus. Med. 2006; 16: 200–203. doi: 10.1111/j.1365-3148.2006.00656.x.
  10. Karimi M., Nikrooz P., Kashef S., Jamalian N., Davatolhagh Z. RBC alloimmunization in blood transfusion-dependent beta-thalassemia patients in southern Iran. Int. J. Lab. Hematol. 2007; 29: 321–326. doi: 10.1111/j.1365-2257.2006.00856.x.
  11. Минеева Н.В., Кробинец И.И., Пашкова И.А., Сысоева Е.А. Аллосенсибилизация к антигенам эритроцитов. Онкогематология. 2015; 10 (4): 60–65. doi: 10.17650/1818-8346-2015-10-4-60-65.
  12. Каландаров Р.С., Головкина Л.Л., Васильева М.Н., Стремоухова A.Г., Пушкина Т.Д., Атрощенко Г.В., Паровичникова Е.Н. Генотипирование групп крови систем AB0 и резус у пациентов после множественных гемотрансфузий. Онкогематология. 2017; 12 (2): 70–79. doi: 10.17650/1818-8346-2017-12-2-70-79.
  13. Belsito A., Costa D., Fioritoet C., De Iorio G., Casamassimi A., Perrotta S., Napoli C. Erythrocyte genotyping for transfusion-dependent patients at the Azienda Universitaria Policlinico of Naples. Transfusion and Apheresis Sci. 2015; 52: 72–77. doi: 10.1016/j.transci.2014.12.006.
  14. Castilho L., Rios M., Bianco C., Pellegrino J.Jr., Alberto F.L., Saad S.T.O., Costa F.F. DNA-based typing of blood groups for the management of multiply-transfused sickle cell disease patients. Transfusion. 2002; 42: 232–238. doi: 10.1046/j.1537-2995.2002.00029.x.
  15. Remeikiene D., Ugenskiene R., Inciura A., Savukaityte A., Raulinaityte D., Skrodeniene E., Simoliuniene R., Juozaityte E. Duffy and Kidd genotyping facilitates pretransfusion testing in patients undergoing long-term transfusion therapy. Turk. J. Haematol. 2014; 31: 367–373. doi: 10.4274/tjh.2013.0075.
  16. Rujirojindakul P., Flegel W.A. Applying molecular immunohaematology to regularly transfused thalassaemic patients in Thailand. Blood Transfus. 2014; 12: 28–35.
  17. Legler T.G., Eber S.W., Lakomek M., Lynen R., Maas J.H., Pekrun A., Repas-Humpe M., Schröter W., Köhler M. Application of RHD and RHCE genotyping for correct blood group determination in chronically transfused patients. Transfusion. 1999; 39: 852–855. doi: 10.1046/j.1537-2995.1999.39080852.x.
  18. Kulkarni S., Choudhary B., Gogri H., Patil S., Manglani M., Sharma R., Madkaikar M. Molecular genoty­ping of clinically important blood group antigens in patients with thalassemia. Indian J. Med. Res. 2018; 148: 713–720. doi: 10.4103/ijmr.IJMR_455_17.
  19. Бессмельцев С.С., Романенко Н.А. Анемия при опухолевых заболеваниях системы крови. Руководство для врачей. М.: СИМК. 2017; 228 с.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Эко-Вектор, 2021


СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ЭЛ № ФС 77 - 75008 от 01.02.2019.