К методике получения стойких кристаллов гэмоглобина

Аннотация

В русской литературе совершенно нет подробных указаний на способы получения кристаллического гемоглобина, и нам кажется, что для врачей будет небезинтересно познакомиться с ними. В нашей лаборатории исследованием гемоглобина занимался мой уважаемый учитель, покойный проф. А. А. Панормов, еще с 1910 года. Им была проделана в этой области очень большая работа, и накоплен обширный сырой материал, который будет впоследствии обработан и опубликован. По его предложению и я занялся исследованием гемоглобина коровьей крови.

Полный текст

В русской литературе совершенно нет подробных указаний на способы получения кристаллического гемоглобина, и нам кажется, что для врачей будет небезинтересно познакомиться с ними.

В нашей лаборатории исследованием гемоглобина занимался мой уважаемый учитель, покойный проф. А. А. Панормов, еще с 1910 года. Им была проделана в этой области очень большая работа, и накоплен обширный сырой материал, который будет впоследствии обработан и опубликован. По его предложению и я занялся исследованием гемоглобина коровьей крови.

Микроскопические кристаллы этого гемоглобина были получены еще Kunde в 1852 году. Однако добыть эти кристаллы в больших количествах исследователям, работавшим после Кundе, не удалось в виду их легкой растворимости. При этом с подробными аналитическими результатами по данному вопросу имеется в литературе только одна работа Hüfnеr’а. Что касается работы Butterfield’a, появившейся через 22 года после Hüfnеr’овской, то ее автор, получив гемоглобин коровьей крови по способу Норрe-Sеуlеr’а. при помощи центрифуги, делавшей 2000—2400 оборотов в 1', определял в нем лишь одно железо.

Hüfner, взяв в основу тот же метод Hoppe-Seyler’a, получал кристаллы гемоглобина коровьей крови таким образом: свежедефибринированная кровь коровы отделялась от сыворотки механически, центрифугированием в цилиндрах при 900—1000 оборотах в минуту, продолжавшимся более 2 часов; после этого сыворотка сливалась, кашица кровяных телец перемешивалась с равным об’емом физиологического раствора поваренной соли, смесь центрифугировалась еще раз и растворялась в центрифугальных цилиндрах, при осторожном встряхивании, при температуре 30—40° С, в дестиллированной воде, которая предварительно кипятилась и опять охлаждалась до указанной температуры; к охлажденному до 0° раствору гемоглобина прибавлялась небольшими порциями ⅓ по об’ему охлажденного до 0° чистого спирта, смесь встряхивалась и оставлялась стоять в охлаждающей смеси из льда и поваренной соли от 24 до 48 часов. Полученные кристаллы центрифугировались и промывались смесью из воды и спирта. Чтобы избежать растворения их во время центрифугирования (так как смесь в это время постепенно нагревается), Hüfner покрывал всю центрифугу точно пригнанным цинковым ящиком, который наполнял охлаждающей смесью. Получившаяся кристаллическая масса растворялась с целью перекристаллизации, и такая перекристаллизация делалась 3 раза, причем получались красные кристаллы иглообразной формы. Кристаллическая кашица последней кристаллизации раскладывалась на пористой глиняной пластинке и оставлялась стоять над серной кислотой при 8° около 24 часов. Высушенные таким образом кристаллы легко растворялись в воде обыкновенной температуры, причем раствор их перед фотометром давал правильное частное число  разбавленной насыщенной кислородом крови. В пепле 10 граммов кристаллической субстанции Hüfner находил невесомые следы фосфорной лоты, что указывает на невполне чистый препарат, ибо фосфора не только в гемоглобине млекопитающих, но и птиц нет (см. статью д-ра А. Н. Полякова в № 3 „Каз. Мед. Журнала“ затек, год).

Мы получали кристаллы коровьего гемоглобина, пользуясь способом нашей лаборатории, который представляет из себя существенное изменение способа Норре-Sеуlеr’а. Один литр дефибринированной крови центрифугировался при 1500 оборотах в 1' влечение одного часа, осевшие кровяные шарики сливанием освобождались от сыворотки и лейкоцитов, промывались 2% раствором NaCl в центрифугальных банках емкостью в 500 куб. сант. и снова центрифугировались. Промывание повторялось 2—3 раза. Промытая кашица кровяных шариков начисто смывалась дестиллированной водой сначала в градуированный цилиндр—для измерения об’ема, затем в колбу, куда при постоянном взбалтывании приливалась вода и 100 к. с. эфира с таким расчетом, чтобы получился один литр лакового раствора. Последний центрифугировался еще раз влечение одного часа, чтобы по возможности отделить строму шариков, сливался в банку, охлаждался на открытом воздухе за окном до 0’ (работа с гемоглобином производилась зимой), и к нему, при энергичном встряхивании, очень медленно прибавлялся охлажденный до 0° 95% алкоголь в количестве 40—50 куб. сант. на 100 куб. сант. раствора; после этой процедуры смесь выставлялась на холод, где несколько раз встряхивалась.

При температуре от 5° до 10° вся смесь в короткое время превращалась в густую кристаллическую массу. Под микроскопом при комнатной температуре в ней видны были большие, длинные, шестисторонние призмы красного цвета с приставшей к ним кое-где стромой. Для перекристаллизации полученная кристаллическая масса переливалась в холодные центрифугальные банки и центрифугировалась втечении 3—5 минут (при более длительном центрифугировании оседала строма), после чего маточный раствор сливался, кристаллическая кашица промывалась охлажденным до 0° раствором из 100 куб. сант. воды, 40 куб. сант. спирта и 1—1,5 куб. сант. эфира и снова центрифугировалась. Затем жидкость сливалась, кристаллы растворялись в возможно малом, измеренном количестве воды. Полученные засохшие комочки легко растирались в ступке в мелкий порошок красно-коричневого цвета. Из одного литра крови получалось 65 грм. воздушно-сухих кристаллов.

Чистота полученного препарата Нufner’ом определялась фотометрически, что более сложно и требует дорого стоющего аппарата. Наша проба на чистоту препарата производилась гемометром Fleischl - Miescher’а по способу, предложенному проф. А. А. Панормовым, таким образом: из 1 куб. сант. раствора гемоглобина делалось разведение, и определялось число на шкале гемометра, после чего узнавался вес сухого остатка в 1 куб. сант. того же раствора; отношение найденного числа к весу и было критерием чистоты, если оно не давало резких колебаний. Разведение делалось такое, чтобы полученные на шкале числа не превышали 40. Это производилось с тем расчетом, чтобы, во первых, ошибка в наблюдении была приблизительно одинакова, во-вторых, в этом районе не получалось резких колебаний при отдельных определениях.

Если разведение делалось меньше, чем 1:1000, то оно приводилось к таковому при вычислении отношения. Напр., при разведении 1:800 отношение равно, а при разведении 1:1000 оно будет равно 144,2X0,8=115,36. Из таблицы видно, что после 4-й кристаллизации колебания в отношениях были у нас очень незначительны, и потому мы полагаем, что после 5-й кристаллизации получался уже вполне чистый преппарат. Для вычисления мы предлагаем формулу К, где F—число, полученное в гемометре Fleischl-Miescher’a, Р—вес сухого остатка, S—разведение и К—критерий чистоты.

В заключение приведем некоторые анализы, которые мы проделали с полученным указанным путем гемоглобином.

А) Анализы для определения воды.

1)Навеска в 1,6773 грм. кристаллической массы, отжатой в гладком фильтре, потеряла после высушивания в сушильном шкафу при 100—110° С 0,801 грм. или 47,27%

2)Навеска в 2,6435 грм. потеряла 1,2537 (47,43%).

3)„                  в 2,0893 грм. „                             0,9884 (47,3).

Б) Анализы для определения азота (определялся по Кjеldаl’ю и Dumas).

аа) По Kjeldalʹю: 1) Навеска 0,1988 грм., связано 22,8 H₂S0₄₇ титр которой равнялся 0,001423 N, т. е. N было 16,3%.

2)Навеска     0.2018 грм., связано Н₂SO₄ 22,9,                          N—16,15%.

3)„              0,2113 грм., „ „ 24,41,                       N—16,43%.

4)„              0,1806 грм.,   „        „ 20,81,   N—16,4%.

бб) По Dumas: 1 ) Навеска 0,2081                 грм., об’ем    N 30,5, t° 22%

дав. 757.14, N—16, 48%.

2) Навеска 0,2072 грм., об’ем, t° и дав. те же, N—16,48%.

В) Анализы С и Н (определение производилось сжиганием в закрытой трубке):

1)Навеска     0,2095      грм., С—54,81%,                     Н—7,2%.

2)„              0,1857      грм., С—54,95%,                    Н—7,24%.

3)„       0,2004            грм.,   С—54,7%,      Н—7,27%.