On changes in the biochemical properties of tubercle bacillus due to its dissociation

Abstract

On the question of the variability of microbes, since 1888, an enormous amount of material has been accumulated. Hadley (1927), in his monograph, brilliantly summarized all the facts, observations and opinions and subordinated them to the main hypothesis, which is an answer to the question about the essence of the very process of variability. Namely: according to Hadley, each microbial species undergoes a certain cycle of development during its life (dissociation); variability is the external expression of this dissociation.

Full Text

По вопросу об изменчивости микробов, начиная с 1888 г. накопился огромный материал. Hadley (1927 г.), дал в своей монографии блестящий итог всем фактам, наблюдениям и мнениям и подчинил их основной гипотезе, которая является ответом на вопрос о сущности самого процесса изменчивости. Именно: каждый микробный вид по Hadley проделывает в течение жизни определенный цикл развития (диссоциация); изменчивость же есть внешнее выражение этой диссоциации. Понадобилось много лет прежде чем удалось доказать, что разнообразные формы колоний укладываются в типы S, О и R и переход основного типа колоний S в R и обратно есть проявление жизненного цикла микробов. Этот цикл, который установлен для большинства микробов, есть так назыв. малый цикл развития и сопровождается изменением морфологических и биологических свойств бактериальной клетки. Изучение свойств возникающих вариантов привело некоторых ученых к допусканию существования и большого цикла развития, т. е. изменчивости не только в пределах вида, но пределах семейства или группы. Так, на съезде бактериологов в 1921 г. проф. Златогоров считал возможным утверждать, что для возникновения эпидемии дизентерии или паратифа нет нужды в экзогенной инфекций, ибо микробы, вызывающие эти заболевания, могут по его мнению возникнуть из непатогенных coli, вследствие изменчивости последних. Для объяснения существования большого цикла развития необходимо допустить, что в процессе диссоциации 2 микробных вида приходят в какое-то соприкосновение и в результате скрещивания происходит образование гибридных рас с последующим их расщеплением. В каком пункте микробам приходится прибегать для поддержания жизни к половому процессу и между какими видами этот процесс возможен— вопросы исключительной важности. В ответах на них заложены предпосылки для понимания причин возникновения и угасания эпидемий, того или иного течения и исхода болезней и даже этиологии заболеваний; Туберкулезная палочка с ее сложным и непонятным пока циклом развития принадлежит как раз к категории тех микроорганизмов, где изучение биологии вариантов, сущности цикла, может открыть завесу над вопросом об этиологии туберкулеза. Если для палочки Коха доказано существование малого цикла развития (как и для большинства микробов) с внешним отображением в виде колоний типа S, R и О, то наши работы в области биологии возбудителя (Б. Л. Мазур) доказали существование „синего“ варианта тоже с малым циклом развития, наличие „синего “бактериофага, а в совокупности для возбудителя туберкулеза (а не туберкулезной палочки)—большого и сложного цикла развития. Изучение биологии вариантов таким образом должно нам дать ключ к разрешению законов, лежащих в основе этого цикла, а установление места Коховской или „синей“ палочки в этом цикле (в начале, середине или конце цепи)—явится наконец ответом на вопрос об этиологии туберкулеза со всеми вытекающими отсюда последствиями.

Наши исследования в области биологии вариантов мы решили начать с наиболее близкого в цикле развития к туберкулезной палочки, с так называемого гомогенного кислотоупорного штамма типа Ferran‘а Аrloing‘a. Этот вариант, полученный еще в 1896 г. из классической туб. палочки, может быть на основании наших исследований получен из „синего“ варианта (в пределах первых генераций), как переходная ступень (не обязательная) к палочке Коха. В процессе изучения гомогенного штамма нам удалось сделать одно интересное наблюдение. Именно: обычные мясопептонные или минеральные среды, употребляемые для выращивания туберкулезной палочки, являются для гомогенных штаммов слишком концентрированными, и след, гомогенный штам растет быстрее и обильнее в разведенном в 20—30 раз бульоне с 0,5% глицерина, чем в неразведенном. Исходя из этого, мы для получения гомогенных штаммов из классических поступали таким образом: мы разводили в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 27, 28, 29 и 30 раз среду Moделя (с 5% глицерина) или глицериновый бульон, разливали среду по 6 куб. с. и засевали штаммом, который хорошо развивается на этих средах. Обычно на всех разведениях получается пленка, но в нескольких пробирках (трудно предсказать разведения) получается через 1—2 недели помутнение среды и, следовательно, отщепление гомогенного варианта. В дальнейшем этот полученный штамм пересевается на разведенный бульон в 20 раз+0,5% глицерина или на одну из сред, которая будет указана ниже.

При изучении биохимии полученного гомогенного штамма мы не могли, разумеется, ориентироваться сразу на детальное изучение и освещение всех его биохимических особенностей; на первое время мы ограничила себя более скромной задачей—определить отношение гомогенного штамма к некоторым биологическим „стандартам“ классической туб. палочки, этого наиболее изученного патогенного микроба. Нашей основной питательной средой была синтетическая, след, состава (не концентрированная).

На этой среде гомогенный штамм растет вполне хорошо. Первая серия наших опытов заключалась в качественном определении отношения гомогенного штамма к различным источникам азота и углерода. В указанной выше среде мы заменяли сернокислый аммоний на тот или другой азотосодержащий ингридиэнт, а глицерин на соответствующий источник углерода. Среди последних нас интересовали почти исключительно углеводы. Концентрация исследуемых веществ подбиралась соответствующей в основной среде, а азот-содержащие вещества дозировались по азоту (11—12 mgr. N на 100 ст. среды).

Определение Ph производилось колориметрически по Михаэлису, депрессия в приборе Бекмана, фосфор по Fiske и Sub- barow. Глицерин определялся путем окисления его К₂Сr₂О₇ в резко кислой среде по Fellenberg‘y. Правда этот способ не является совершенно безупречным потому, что бихромат может окислять в большей или меньшей мере большинство органических веществ. Но глицерин окисляется бихроматом количественно, а щавелевая кислота, которая в виде солей имеется в среде, является абсолютно резистентной. Так как других органических веществ, возникших в результате жизнедеятельности бактерий, количественно по сравнению с глицерином немного, то способ Fellenberg'a и может быть применен для определения последнего. Глюкоза определялась по способу Willstätter‘a и Schudel'a. KN₃ определялся колориметрически с сульфофеноловым раствором. Азот определялся по Кьедалю, аммонийный азот в приборе Парнаса с последующей колориметрией. Гликоколл и казеин определить, как таковые мы не были в состоянии по ряду обстоятельств, поэтому мы довольствовались определением общего азота профильтрованной и освобожденной от бактерий среды. Вес сухих бацилл определить было трудно, так как центрофугирование не давало отделения микробов от среды, а фильтрование через фильтр (голубая лента Schleicheг’а и Schüll’a) в Бухнеровской воронке оказалось тоже не простой операцией, так как фильтры «быстро засорялись. Результаты этой серии опытов представлены в таблицах III—VIII, диаграммы I—III.

Диаграмма 1. Повышение точки замерзания сред.

Диаграмма 2. Убыль глицерина в-mgr.

Диаграмма 3. Убыль фосфора в 0,001, mgr

Ph сдвигается в этой среде в щелочную сторону (этой средой мы и пользуемся в настоящее время для пересевов наших штаммов). Несколько худшим субстратом, но все таки еще оптимальным является среда с сернокислым аммонием (среда № 1). Использование глицерина, фосфора на ней достаточно хороши. До 30-го дня Ph этой среды сдвигается в кислую сторону, а потом в щелочную. Гликоколл (среда № 4) и казеин (среда № 5) являются худшими азотосодержащими субстратами для гомогенного штамма, нежели KNО₃ и аммоний; рост получается несколько замедленный, но вполне отчетливый. Глюкоза (среда № III) усваивается хуже глицерина, по ее использование стоит вне всякого сомнения; только на П-ом месяце получается более или менее интенсивный рост.

Диаграмма 4. Убыль KNO3.

Диаграмма 5. Убыль глюкозы.

Несколько слов относительно среды № 2, где отсутствовал какой бы то ни было источник азота. Мы хотели определить на этой среде способности гомогенного штамма усваивать азот из воздуха. Результаты получились отрицательные. Правда, при каждом пересеве получается незначительный рост, но это, повидимому, за счет минимальных примесей, содержащихся в среде, ибо прогрессивного роста, свидетельствующего об усвоении азота из воздуха—мы не наблюдали.

Какие же биохимические особенности гомогенного варианта по сравнению с классической? Основным отличием его является отношение к источникам азота и именно усвоение KNO₃ и NaNO₃—факт не отмеченный до сих пор ни для ВК, ни для какого-либо патогенного штамма вообще. Если для туберкулезной палочки было известно на основании многочисленных работ, что нитраты, нитриты, белки, пуриновые производные не являются сколько-нибудь подходящими субстратами, то гомогенный штамм растет на всех этих средах, при чем KNO₃, абсолютно неприемлемый для классической туб. палочки, для него является оптимальным. Интересно, что нитриды не являются, очевидно, промежуточными продуктами превращений KN0₃ в восстановленный органический азот, так как они не обусловливают рост туберкулезной палочки. Мы не сомневаемся в том, что можно подобрать и для других азотосодержащих субстратов, кроме нитратов и аммония, возможно более оптимальные условия (Ph, характер углеродного субстрата и проч.) чем те, которые у нас отмечены, но все же в усвоении азота заключаются наиболее характерные особенности гомогенного штамма.

Усвоение углеводов не представляет больших отличий или особенностей сравнительно с ВК. Это относится как к глицеринофилии так и к абсолютному неиспользованию дисахаридов, трисахаридов и растворимого крахмала.