The role of heparin in the process of physiological inactivation of α-thrombin

Abstract

Heparin as a strong and fast acting anticoagulant has found wide application in clinical practice.

Full Text

Гепарин как сильный и быстро действующий антикоагулянт нашел широкое при-, менение в клинической практике. Этот препарат используется для лечения и профилактики тромбоэмболических осложнений самой различной локализации и этиологии, Гепаринотерапия успешно проводится при тромбогеморрагическом синдроме, инфаркте миокарда, хронической ишемической болезни сердца, атеросклерозе и других заболеваниях [1]. Установлено, что антикоагулянтные свойства гепарина в значительной степени определяются его способностью резко ускорять инактивацию тромбина и других ферментов системы свертывания крови антитромбином-ингибитором, присутствующим в плазме [38, 39, 47]. Выяснение вопроса о механизме действия гепарина в этих реакциях представляется существенным для совершенствования методов профилактики и лечения тромбогеморрагических состояний с помощью указанного антикоагулянта.

Целью данного обзора было обобщение полученных к настоящему времени данных о молекулярном механизме физиологической инактивации а-тромбина, протекающей при участии гепарина.

Одним из важнейших физиологических механизмов предотвращения тромбозов является инактивация ферментов системы свертывания крови, в частности а-тромбина, в кровеносном русле. Частичная нейтрализация активности а-тромбина обеспечивается его адсорбцией сгустком фибрина [2, 43], однако основная антитромбиновая активность крови обусловлена присутствием в плазме специфических белков, способных 'Связывать а-тромбин и другие протеазы, что вызывает их инактивацию [27, 43].

Установлено, что основным ингибитором а-тромбина в плазме является антитромбин¹ [10, 43], представляющий собой одноцепочечный гликопротеин с молекулярной массой около 58000 [20, 28]. Его концентрация в плазме в норме составляет 190—300 мг/л или 3—5 мкмоль/л [43]. По данным Розенберга и Дамуса (1973), антитромбин нейтрализует активность а-тромбина путем образования с этим ферментом эквимолярного стехиометрического комплекса. В основе данной реакции лежит специфическое взаимодействие серина — активного центра фермента и аргинина —«реактивного центра» ингибитора. Согласно Оуэну (1977), в процессе инактивации между а-тромбином и антитромбином образуется ковалентная, по-видимому, ацильная связь.

Гепарин¹⁾²⁾ значительно ускоряет инактивацию а-тромбина, не оказывая при этом влияния на стехиометрию комплекса фермент-ингибитор и природу образующейся между белками связи [39].

Розенберг и соавт. (1973, 1977) установили, что остатки лизина в молекуле антитромбина принимают непосредственное участие в связывании гепарина. Хотя химическая модификация этих остатков не отражалась на способности антитромбина к взаимодействию с а-тромбином, скорость инактивации фермента модифицированным ингибитором в присутствии гепарина не возрастала. На основании этих данных авторы предположили, что избирательное связывание гепарина с остатками лизина антитромбина вызывает в молекуле последнего конформационный сдвиг, способствующий более благоприятному расположению реактивного центра, что в конечном счете приводит к ускорению взаимодействия ингибитора с ферментом.

Данная гипотеза получила ряд экспериментальных подтверждений. Как известно, препараты гепарина неоднородны и представляют собой смесь. молекул, отличающихся по молекулярной массе [16, 22], химической структуре [8, 9, 15] и антикоагулянтной активности [7, 22]. Препараты гепарина, применяемые в нашей стране , (производства Минска, Каунаса, Баку, ВНР и ЧССР) негомогенны по молекулярной массе. В отечественных препаратах содержится относительно большая доза низкомолекулярных фракций гепарина [4]. Эксперименты, основанные на использовании способности гепарина специфически связываться с антитромбином, позволили разделить гетерогенные препараты гепарина на две фракции [5, 13, 21]. Фракция, обладающая способностью связываться с антитромбином с высоким средством, составляла приблизительно 7з от массы исходного препарата и содержала около 90% его антикоагулянтной активности (так называемый высокоактивный гепарин). Остальная часть исходного материала была практически лишена способности связываться с антитромбином и имела низкую активность (низкоактивный гепарин). Корреляция антикоагулянтной активности гепарина с его способностью связывать антитромбин свидетельствует о существенной роли взаимодействия ингибитора с гепарином в процессе инактивации «-тромбина. В последующих экспериментах, включающих химическую или ферментативную деградацию высокоактивного гепарина [23, 56, 57], были выделены углеводные фрагменты, представляющие собой, по мнению авторов [14, 41, 42], участки связывания антитромбина. Оказалось, что для осуществления специфического связывания этого ингибитора гепарином необходима определенная последовательность моносахаридных единиц, отдельные структурные компоненты которой были идентифицированы [24, 25, 41, 42]. Следует отметить, что наименьший фрагмент молекулы гепарина, сохраняющий способность ускорять взаимодействие а-тромбйна с антитромбином, образован 14 моносахаридными единицами [34].

В ряде работ [17, 19, 29, 30] было установлено, что высокоактивный гепарин с молекулярной массой от 6000.до 35000 образует с антитромбином эквимолярный стехиометрический комплекс с константой диссоциации 10—⁷—10~⁸М. Согласно данным адсорбционной и флюоресцентной спектроскопии [17, 29, 30, 32, 33], при взаимодействии гепарина с антитромбином в молекуле последнего происходит конформационный сдвиг. Взаимодействие гепарина с а-тромбином может играть существенную роль в процессе инактивации фермента.

Итак, гепарин способен с высоким сродством связываться как с а-тромбином, так и с антитромбином, что приводит к появлению двух альтернативных гипотез механизма действия указанного антикоагулянта в реакции инактивации а-тромбина. С учетом данных, согласно которым связывание гепарина как с антитромбином, так и с а-тромбином существенно для увеличения скорости инактивации фермента [39], Померантэ и Оуэн (1978) предположили, что в процессе инактивации фермент и ингибитор одновременно связываются с одной молекулой гепарина; это ускоряет их взаимодействие. Группа авторов, анализируя зависимость антикоагулянтной активности гепарина от его молекулярной массы, заключила, что для достижения максимальной скорости инактивации а-тромбина необходимо связывание молекулы фермента со свободным участком полисахаридной цепи гепарина рядом с молекулой ингибитора [23, 45]. На основании этих данных Холмер и соавт. (1979) выдвинули следующую гипотезу механизма действия гепарина в реакции инактивации а-тромбина. Первоначально антитромбин связывается, со специфическим участком в молекуле гепарина, что вызывает конформационный переход, способствующий ускорению взаимодействия ингибитора с а-тромбином. Затем свободный участок полисахаридной цепи гепарина связывает молекулу а-тромбина, которая на следующем этапе процесса инактивируется ранее связавшимся ингибитором. Взаимодействие а-тромбина со свободной молекулой гепарина замедляет инактивацию, поскольку это явление препятствует связыванию фермента с молекулой гепарина, уже вступившей в комплекс с антитромбином [17, 18].

В некоторых работах [11, 17, 40] отмечается существенная особенность, характеризующая механизм влияния гепарина на скорость инактивации а-тромбина, а именно «каталитический» характер действия этого антикоагулянта, заключающийся в том, что для увеличения скорости взаимодействия а-тромбина с антитромбином вплоть до максимальных значений достаточно присутствие гепарина в молярной концентрации, значительно более низкой, чем концентрации реагирующих белков. Как было установлено Йорданом и др. (1979), данное явление обусловлено тем, что после образования стабильного комплекса а-тромбина с антитромбином молекула гепарина диссоциирует и способна вновь связаться со свободным ингибитором. Следовательно, одна молекула гепарина может последовательно ускорять взаимодействие многих пар молекул а-тромбина и антитромбина. Этому процессу в значительной степени способствует то, что сродство гепарина к стабильному комплексу фермент-ингибитор существенно ниже, чем к свободному антитромбину [11, 17].

В заключение необходимо отметить, что мы рассмотрели механизм действия гепарина лишь в одной из гемостатических реакций, осуществляемых при его участии. Однако антикоагулянтный эффект, наблюдаемый при взаимодействии гепарина с плазмой крови, обусловлен целым рядом процессов: ускорением инактивации антитромбином наряду с а-тромбином факторов Ха [47], IXa, Х1а, ХПа [38], ингибированием активации факторов X и протромбина, вызванным нарушением связывания факторов свертывания с поверхностью фосфолипидов [31, 46], и, наконец, образованием комплексов с целым рядом белков плазмы, что препятствует свертыванию фибриногена и создает фон неферментативной фибринолитической активности [3]. Некоторые полученные к настоящему времени данные [5, 45 46] позволяют заключить, что структурные характеристики, обеспечивающие активное функционирование гепарина, в различных гемостатических реакциях, осуществляемых при его участии, неодинаковы. Более того, гомогенная фракция гепарина, обладающая определенной химической структурой, по-видимому, не может служить полноценным аналогом природного материала в обеспечении всех многообразных аспектов его антикоагулянтного действия [45].

1)Другие названия: антитромбин II, антитромбин III, а₂-антитромбин, антитромбин-кофактор гепарина, кофактор гепарина, ингибитор фактора Ха [6, 44а, Ь].

2) Этот антикоагулянт, обнаруженный в тучных клетках ряда тканей, по химической природе является гликозаминогликаном [2]. Мы не будем останавливаться на его химической структуре, так как она неоднократно рассматривалась ранее [2, 16, 40].