To the mechanism of hemostatic action of catecholamines

Abstract

50 years ago, after detailed studies by V. Kennon and his collaborators [6], it was undeniably shown that adrenaline accelerates blood coagulation in animals. Later, these data were confirmed by numerous studies.

Full Text

50 лет назад после детальных исследований В. Кеннона и его сотрудников [6] с неоспоримостью было показано, что адреналин вызывает ускорение свертывания крови у животных. В дальнейшем эти данные были подтверждены многочисленными исследованиями. Адреналин добавляли к растворам анестезирующих средств для ускорения гемостаза в операционной ране. Однако механизм действия адреналина на свертывание крови до сегодняшнего дня не выяснен. Предполагают, что это действие непрямое и что оно обусловлено поступлением в кровоток компонентов свертывающей системы из тканей [2, 9, 10].

В 1964 г. Ратнофф и Крам [14] обнаружили активацию фактора Хагемана под действием таннина, пирокатехина и эллаговой кислоты. Поскольку все эти соединения имеют в своих молекулах гидроксилы в ортоположении, мы поставили задачей иссле­довать в аналогичных экспериментах влияние адреналина и норадреналина, которые являются физиологическими регуляторами ряда функций организма.

Реактивы. 1. Веронал-мединаловый буфер pH 7,5 (7,8 г хлористого натрия, 2,74 г веронала, 2,06 г мединала и бидистиллированной воды до 1 л).

2.0,1% и 0,01% растворы таннина в буфере.

3.0,01 М и 0,001 М растворы пирокатехина (Мерк) в буфере.

4.0,01 М и 0,001 М растворы адреналина гидротартрата (Украинского института экспериментальной эндокринологии, г. Харьков) в буфере.

5.0,01 М и 0,001 М растворы норадреналина (Украинского института экспери­ментальной эндокринологии, г. Харьков) в буфере.

6.0,1% раствор фармакологического адреналина (Ивановского и Московского мя­сокомбинатов). После доведения pH раствора до 7,5 0,1 М раствором NaOH в нем содержалось 0,0266% адреналина и 0,0145% норадреналина. Содержание катехолами­нов определяли флюорометрическим методом Э. Ш. Матлиной [3].

7.0,025 М раствор хлористого кальция.

8.Бестромбоцитарную интактную плазму готовили путем двойного центрифугиро­вания крови, стабилизированной цитратом, при 6000 или 10 000 оборотов в минуту в течение 20 мин. при 0° С. У людей кровь брали из вены платиновой иглой в пара­финированные полиэтиленовые пробирки, содержащие 3,8% раствор трехзамещенного цитрата натрия (отношение стабилизатора к крови— 1:9), у животных и птиц —из бедренной и сонной артерий в силиконированные мерные канюли, содержащие тот же антикоагулянт. Количество оставшихся тромбоцитов в плазме после центрифугирова­ния не превышало 150 в 1 мм³.

9.Для получения активированной плазмы 1 мл интактной плазмы вращали в те­чение 10 мин. с 1 г стеклянных шариков (фирмы Браун, ФРГ) с общей активирую­щей поверхностью 28,8 см².

10.Истощенную плазму получали из бестромбоцитарной интактной плазмы, ко­торую обрабатывали 20 мин. целитом (Hyflo supercel Chemical and Dyes, London) при 37° С из расчета 30 мг/мл [13]. Целит отделяли центрифугированием, а плазму пере­носили в свежесиликонированную пробирку и выдерживали при 37° С еще 5—18 ча­сов. Такая плазма лишена способности активироваться при взаимодействии с чуже­родными поверхностями и может храниться при — 25° С до 2 месяцев. Человеческую плазму мы готовили накануне, а кроличью и бычью сохраняли при —25° С и исполь­зовали по мере надобности.

Методика. К 0,1 мл раствора испытуемого вещества, находящегося в силиконированной пробирке и предварительно прогретого в водяной бане до 37° С, добавля­ли 0,1 мл плазмы. После трехминутной инкубации при отсутствии ионизированного кальция смесь рекальцифицировали 0,1 мл раствора СаСl. При такой постановке опыта изменения в системе свертывания крови, происходящие во время инкубации, пред­ставляется возможным относить за счет активации XII и XI факторов, ибо для реак­ций, следующих за контактной фазой, обязательно присутствие Са++.

При хранении плазмы время ее свертывания спонтанно изменяется, особенно у со­бак. Поэтому каждое определение сопровождалось контролем, в котором регистриро­валось время свертывания плазмы после инкубации с вероналовым буфером.

Статистический анализ результатов опытов проведен по Фишеру [5].

Результаты. Трехминутная инкубация интактной плазмы с раствором тан­нина (конечная концентрация 0,03—0,003%) вызывала ускорение свертывания в сред­нем на 39% (табл. 1).

Влияние таннина на время свертывания (в сек.) кроличьей интактной
и активированной плазмы

Вид плазмы	Время свертывания при инкубации с		Разность	Р
	буфером	таннином
Интактная	603,72	367,55	—236,17	<0,001
Активированная	91,76	87,60	—4,16	>0,5

В дополнение доказательств, представленных Ратнофф, что влияние таннина и. пирокатехина опосредовано через фактор Хагемана, мы обнаружили, что предваритель­ная контактная активация плазмы стеклянными шариками предотвращает действие этих веществ на скорость коагуляции (табл. 1). Если бы влияние таннина было опо­средовано через другие звенья свертывающей системы крови, то оно должно было бы суммироваться с действием контактной активации, так как каждый этап свертывания имеет свою константу скорости реакции.

Под действием фармакологического адреналина, получаемого из надпочечников крупного рогатого скота, время свертывания интактной плазмы также ускорялось. Стимулирующее влияние фармакологического адреналина на гемокоагуляцию по вы­раженности мало отличалось от действия таннина (табл. 2 и 3). Так как в фармаколо­гическом адреналине в качестве консерванта содержится хлорэтон, для опытов были использованы и синтетические препараты гидротартрата адреналина и норадреналина.

Таблица 2

Влияние адреналина и норадреналина на время свертывания интактной плазмы кроликов (в сек.)

Плазма инкубирована с			Разность	р
буфером	фармакологи­ческим адре­налином	синтетическим адреналином
659,2 503,4	449,0	372,8	—210,2 —130,6	<0,001 <0,001

Влияние адреналина, норадреналина, пирокатехина и таннина на время свертывания интактной плазмы человека (в сек.)

Плазма инкубирована с						Разность	P
буфером	таннином	пирокате­хином	фармаколо­гическим ад­реналином	синтетиче­ским адре­налином	норадрена­лином
483,4 475,0 446,6 481,3 450,4	351,2	319,2	319,6	556,2	320,3	—132,2 —155,8 —127,0 +74,9 —130,1	<0,001 <0,001 <0,001 <0,05 <0,001

Эти препараты, так же как таннин и пирокатехин, стимулировали свертывание интактной плазмы человека и животных.

Плазма кроликов сравнительно с плазмой человека была менее чувствительна к норадреналину. Синтетический адреналин не ускорял свертывания плазмы человека, тогда как фармакологический адреналин оказывал такое влияние.

Способностью ускорять свертывание плазмы обладали не только свежеприготов­ленные растворы катехоламинов, но и растворы, хранившиеся при комнатной темпе­ратуре. В первые 2 суток действие адреналина на гемокоагуляцию по мере образова­ния адренохрома даже несколько увеличивалось. Подобная закономерность была ра­нее отмечена Ратнофф и Крам при использовании растворов таннина, пирогаллола и пирокатехина.

Поскольку ускорение свертывания может быть вызвано действием катехоламинов на разные звенья процесса гемокоагуляции, представляющего собой каскад превраще­ний неактивных проферментов в активные, дальнейшие опыты были направлены на выяснение роли контактной фазы в реализации влияния этих веществ. Предварительная активация фактора XII в цитратной плазме кролика стеклянны­ми шариками сопровождалась укорочением времени свертывания при рекальцифика­ции с 8—16 мин. в среднем до 87 сек. Добавление растворов биогенного и синтетиче­ского адреналина практически не отразилось на времени свертывания такой активиро­ванной плазмы (76,8 сек., Р<0,05).

Инкубация активированной человеческой плазмы с таннином, пирокатехином, ад­реналином и норадреналином способствовала не ѵкорочению, а удлинению свертыва­ния (табл. 4)

Таблица 4

Влияние таннина, пирокатехина, адреналина и норадреналина на время свертывания акгивировйннэй плазмы человека (в сек.)

Плазма инкубирована с						Разность	Р
буфером	таннином	пирокате­хином	фармаколо­гическим ад­реналином	синтетиче­ским адре­налином	норадрена­лином
163,8 187,37 176,92 166,23 181,49	432,2	263,11	188,19	348,66	235,49	+ 268,4 + 75,73 + 11,27 + 182,43  + 54,0	<0,001 < 0 01 <0,001 <0,001 <0,01

В следующей серии опытов испытывали действие катехоламинов на свертывание плазмы, лишенной контактных факторов. В табл. 5 и 6 представлены результаты опы­тов, проведенных с истощенными плазмами кроликов и человека.

Оказалось, что свертывание плазмы без контактных факторов не ускоряется рас­творами ка гехоламипов и таннина. Напротив, оно даже несколько замедляется. Оче­видно, стадии свертывания, следующие за контактной, этими веществами даже не­сколько угнетаются.

Таблица 5

Влияние катехоламинов на время свертывания
истощенной плазмы кролика (в сек.)

Буфер	Таннин	Фармаколо­гический адреналин	Синтетический адреналин	Синтетический норадреналин
391	675	431	509	464

Таблица 6

Влияние катехоламинов на истощенную плазму человека

Время свертывания плазмы при инкубации с						Разность	Р
буфером	таннином	пирокате- хило	фармаколо­гическим адренали­ном	синтетиче­ским адре­налином	синтетиче­ским норад­реналином
430,1 440,18 511,6 506,0 440,0	802,7	471,53	569,7	1075,2	458,3	+372,6 +31,35 +53,1 +569,2 + 18,3	<0 001  <0,05  <0,1 <0, 001 <0.001

Подобные же результаты были получены и с кровью собак.

Согласно данным Ятридиса и Фергюссона кровь кур лишена контактного факто­ра. Чтобы убедиться в этом, мы активировали стеклянными шариками бестромбоци­тарную плазму кур. При этом время свертывания куриной плазмы укорачивалось с 943,8 до 542,4 сек. (Р<0,02). Степень укорочения во много раз меньше, чем у мле­копитающих. На этом основании можно полагать, что в крови кур содержится значи­тельно меньше факторов контактной фазы свертывания, чем у других исследованных нами животных, но утверждение о полном отсутствии их не соответствует действи­тельности.

Влияние катехоламинов на интактную плазму кур

Время свертывания плазмы (в сек.) при инкубации с						Разность	Р
буфером	пирокате­ хином	таннином	фармаколо­гическим ад­реналином	синтетиче­ским адре­налином	норадрена­лином
1149 8    1050.3 1109 0 1134,2 1135,0	936,6	821,3	1437,5	1424,8	1303,2	-110,5 —229,0  +328,5  +290,6  +168,2	<0.05 <0,01 <0,05 >0,7 >0,3

Воздействие катехоламинов на плазму кур, как свидетельствует табл. 7, не со­провождалось ускорением ее свертывания. Небольшая степень активации достигалась лишь пирокатехином и таннином. Аналогичные результаты были получены с плазмой голубей.

Обсуждение. Полученные данные указывают, что свойство катехоламинов ускорять свертывание опосредовано через контактный фактор плазмы, фактор Хагема­на. Он представляет собой глобулин, обладающий эстеразной активностью [15]. Акти­вация при адсорбции на поверхности некоторых твердых тел (стекло, целит, каолин, бентонит, асбест) и капелек жирных кислот [11, 13] с последующим образованием плазменной тромбокиназы и плазмакининов дает право предположить, чго явление аллостеризма имеет непосредственное отношение к регуляции фактора Хагемана. Из­менение седиментационных свойств высокоочищенного препарата фактора Хагемана (фактора XII) при воздействии эллаговой кислоты, вызывающей его активацию [8], на наш взгляд, тоже свидетельствует в пользу высказанного предположения.

Полученные в наших экспериментах результаты можно объяснить стабилизацией активной конформации фактора Хагемана при воздействии катехоламинов. Образова­ние комплексов катехоламинов с белками было показано ранее [4, 7]. В зависимости от условий катехоламины могут реагировать как амины, фенолы, хиноны, спирты или индолы. Активация фактора Хагемана таннином, пирокатехином, пирогаллолом, пур­пурогаллином и эллаговой кислотой позволяет считать, что наличие гидроксилов в ор­тоположении у всех этих соединений и адреналина и норадреналина важно для их действия на молекулу фактора XII.

Использованные в наших опытах концентрации адреналина и норадреналина пре­вышают физиологические. Поэтому возникает вопрос, насколько приложимы получен­ные данные для объяснения регуляции свертываемости крови в организме. Хотя в наших опытах были использованы все известные манипуляции, направленные на предотвращение контактной активации (силиконирование всей посуды, охлаждение крови и плазмы), условия пробирочных опытов нельзя рассматривать как идеальные и целиком гарантирующие от такой активации. На основании наших опытов можно утверждать даже обратное. По мере сохранения плазмы время ее свертывания изме­няется, что указывает на денатурационные превращения. Коль скоро даже в этих условиях без ионизированного кальция удается обнаружить значительную активацию контактной фазы свертывания крови, то в условиях организма, значительно более мягких, действие катехоламинов может оказывать регулирующее влияние на процесс скрытого внутрисосудистого свертывания, видимо, в значительно меньших концентра­циях. Именно активация контактной фазы свертывания является определяющей реак­цией при интактных стенках кровеносных сосудов. Изменения свертываемости крови, по-видимому, отражают сдвиги в стационарных процессах, происходящих в системе гемокоагуляции [1]. Активация фактора Хагемана под действием катехоламинов во всяком случае позволяет высказать предположение, что эта зависимость может иметь значение и для целого организма: в физиологических условиях выделение адреналина надпочечными железами может готовить кровь к более быстрому свертыванию при повреждении целости тела, а в патологических — способствовать внутрисосудистому тромбообразованию.

Обнаруженное нами прямое активирование системы гемокоагуляции под дей­ствием катехоламинов, разумеется, не исключает возможности их косвенного воздей­ствия путем поступления в кровоток тканевых факторов, влияющих на свертывание крови.