Deoxyribonuclease activity of staphylococci isolated in a trauma hospital

Abstract

According to some authors, DNases of pathogenic bacteria play a certain role in the pathogenesis of infectious diseases. It is generally recognized that the pathogenicity of bacteria is closely related to the characteristics of their metabolism.

Full Text

По мнению некоторых авторов, ДНКазы патогенных бактерий играют опреде­ленную роль в патогенезе инфекционных заболеваний. Общепризнанной является тесная взаимосвязь патогенности бактерий с особенностями их метаболизма.

Мы поставили перед собой задачу выяснить, способны ли стафилококки вызы­вать деполимеризацию ДНК, и выявить корреляцию ДНКазной активности штаммов с общепризнанными факторами патогенности стафилококков. Кроме того, мы стреми­лись изучить вопрос о связи ДНКазной активности и всего комплекса признаков вирулентности свежевыделенных штаммов с характером вызываемых ими хирурги­ческих заболеваний.

Исследованию были подвергнуты стафилококки, выделенные от больных, бакте­рионосителей, из воздуха и с различных объектов внешней среды в травматологиче­ском стационаре. Всего исследовано 323 штамма стафилококков, из них 176 свеже­выделенных и 147 лабораторных с давностью выделения 1—10 лет.

Приготовление среды с ДНК. Навеску ДНК (США) из расчета 2 мг на 1 мл среды вносили в пробирку с 5 мл стерильного хоттингеровского бульона (pH = 8,0 — 8,4) и растворяли при подогревании над газовой горелкой, а затем осто­рожно кипятили в течение 3—5 мин. Полученный раствор ДНК переносили во фла­кон со стерильным расплавленным горячим хоттингеровским агаром (95 мл, pH — 8,0—8,4). Содержимое флакона быстро и тщательно перемешивали и разливали в чашки Петри по 16—18 мл (в зависимости от диаметра чашки).

Для обнаружения дезоксирибонуклеазы 1 петлю суточной агаровой культуры лококка засевали «бляшкой» занную среду. На одну чашку различных штаммов. Посевы мостате при 37° 24 часа, затем в таком количестве, чтобы кислота покрыла всю поверхность среды. Через 5—10 мин. кислоту уда­ляли и производили учет результатов. Если культура обладала способностью выделять в среду дезоксири­бонуклеазу, вокруг «бляшек» образовывалась про­зрачная зона, состоящая из продуктов деполимери­зации ДНК, не осаждаемых 1 н. НС1. Вся остальная поверхность среды покрывалась мутным преципита­том из осажденной соляной кислотой ДНК (рис. 1).

О степени ДНКазной активности стафилокок­ков судили по диаметру зоны просветления, изме­ряемому в миллиметрах. Зоны диаметром 13—17 мм отмечались условно « + », 18—22 мм — «++», 23— 27мм— « +++ ».

В первых опытах добавление к среде ионов Са активность ДНКазы. Поэтому в дальнейших исследованиях мы применяли среду без добавления Са.

Рис.1 Изображение ДНКаз­ной реакции стафилококков. Вокруг макроколоний видны зоны просветления.

Для определения ДНКазной активности стафилококков был применен метод Джеффриса (1957) в модификации Ди Сальво (1959) и в несколько упрощенном на­ми виде.

Из 176 штаммов свежевыделенных стафилококков ДНКазной активностью облада­ли 142 (80,5%). Из 147 штаммов лабораторных культур, сохранявшихся в полужидком агаре под слоем вазелинового масла в течение 1—10 лет, ДНКазу продуцировали 145 (98,3%). Это указывает на высокую стабильность способности патогенных ста­филококков к синтезу экстрацеллюлярной ДНКазы. У некоторых лабораторных штаммов отмечалась даже более широкая зона деполимеризации ДНК, чем у свеже­выделенных культур. Аналогичные данные были получены Д. В. Юсуповой (1964), изучавшей ДНКазную активность С. dîphtheriae.

Критериями корреляции между ДНКазной активностью стафилококков и обще­признанными факторами их вирулентности были избраны: способность образовывать золотистый пигмент, продуцировать гемотоксин, плазмокоагулазу, гиалуронидазу и лецитиназу. Перечисленные признаки патогенности определялись по общепринятым методам (Г. Н. Чистович, 1961; Г. В. Выгодчиков, 1963).

Из 287 штаммов ДНКазоположительных стафилококков 286 коагулировали плаз­му. Исключением явился лишь 1 штамм, который давал слабую зону деполимериза­ции ДНК (14 мм). Он был золотистым, гемолитическим, ферментировал маннит, ли­зировался стафилофагом и по комплексу признаков был отнесен к стафилококкам с ослабленной патогенностью.

У ДНКазоположительных стафилококков часто обнаруживались и другие признаки патогенности: лецитиназа (88,3%), гемотоксин (83,4%), золотистый пигмент (84,8%), гиалуронидаза (60%). Следует отметить, что у стафилококков с высокой актив­ностью гиалуронидазы диаметр зоны деполимеризации ДНК был больше, чем у ста­филококков с низкой активностью. Все штаммы стафилококков, способные расщеп­лять лецитины и гиалуроновую кислоту, в 100% случаев продуцировали ДНКазу.

Из 36 штаммов ДНКазоотрицательных стафилококков ни один не обладал коа­гулазой, лецитиназой и гиалуронидазой; лишь 22 штамма из них давали гемолиз на кровяном агаре и один продуцировал золотистый пигмент. Как известно, наличие только гемолиза не может указывать на вирулентность штамма (Г. В. Выгодчиков, Г. Н. Чистович, А. Я. Еселевич).

Вирулентные стафилококки, обладающие «агрессивными» ферментами, способны вызывать деполимеризацию ДНК. Активность ДНКазы коррелирует с различными признаками патогенности и особенно с плазмокоагулазой. Невирулентные стафилокок­ки в наших опытах внеклеточной ДНКазы не выделяли.

Наличие ДНКазы у патогенных стафилококков и отсутствие ее у непатогениых, на наш взгляд, дает основание считать этот фермент составной частью «вирулентно­го оснащения» микроба. Наше предположение согласуется с мнением Л. Месробяну, Э. Пэунеску, Р. Дюбо и Ван-Хейнингена, что ДНКаза, вызывая деполимеризацию ДНК и разжижая вязкие гнойные экссудаты, содержащие эту нуклеиновую кислоту, играет важную роль в процессе распространения микроба-возбудителя и в генера­лизации инфекции.

Для изучения вопроса о связи ДНКазной активности и всего комплекса факто­ров вирулентности свежевыделенных стафилококков с характером заболеваний были проведены наблюдения на больных ортопедо-травматологического профиля с ослож­ненными травмами, с острыми гнойными процессами, послеоперационными осложне­ниями, хроническим остеомиелитом, с длительно незаживающими язвами и ранами.

При бактериологическом исследовании патологического материала от этих боль­ных было выделено 90 штаммов патогенных плазмокоагулирующих стафилококков. Все они оказались ДНКазоположительными, причем стафилококки, продуцирующие ДНКазу на «+ +», обнаруживались почти в два раза чаще при острых заболева­ниях, тогда как стафилококки с зоной деполимеризации ДНК на «+»—преимущест­венно при хронических. Высокая ДНКазная активность у стафилококков, выделенных при острых хирургических заболеваниях, вероятно, не случайное явление: такая же закономерность была выявлена и в отношении других ферментов — токсинов. Ста­филококки, выделенные при острых заболеваниях, как правило, обладали большей ле­цитиназной и гиалуронидазной активностью и чаще продуцировали гемотоксин.

Полученные материалы показывают, что ДНКазный тест является одним из критериев патогенности стафилококков и может быть рекомендован для применения в лабораторной практике с диагностической целью