Приготовление и применение сапонина для исследования крови на раковые клетки

Аннотация

Исследование крови на опухолевые клетки у больных злокачественными новооб­разованиями имеет определенное значение для уточнения диагноза, оценки эффектив­ности различных методов лечения, радикальности проведенной операции. Представ­ляют интерес и теоретические вопросы — судьба отторгшихся от опухоли опухолевых комплексов и отдельных клеток, их жизнеспособность, пути их распространения.

Полный текст

Метод выделения опухолевых клеток из крови должен удовлетворять следую­щим требованиям: простота и точность в работе, дешевизна и доступность реакти­вов и аппаратуры.

Из всех методов, употребляемых в настоящее время для элиминации опухоле­вых клеток из крови, наиболее простыми являются два метода: флотационный и основанный на гемолизе. Для первого необходимо иметь индифферентную жидкость определенного удельного веса. Исходя из того, что удельный вес эритроцитов колеб­лется в пределах 1,092—1,097, лейкоцитов 1,07—1,08, а раковых клеток в среднем 1,05—1,06 (6, 10, И, 14), выбирают жидкость с удельным весом 1,065—1,075. Для этой цели употребляют альбумин (9), силикон (12). декстран (10). Более легкие опухолевые клетки собираются в верхнем слое. Ни альбумин и декстран определен­ного удельного веса трудно готовить, а силикон с удельным весом больше 1,0 оте­чественной промышленностью не вырабатывается.

При использовании метода гемолиза в настоящее время применяют стрептоли­зин 0, стрептолизин S или сапонин (5, 7, 11, 15). Все эти препараты импортные.

Анализ литературы показывает, что существует несколько методов приготовле­ния сапонина, некоторые из них просты и дают большой процент выхода действую­щих начал. Сапонин, вернее сапонины, содержится во многих растениях. К настоя­щему времени известно около 1000 сапониноносных растений. Содержание сапони­нов колеблется от следов до 50%. Сапонины —безазотистые вещества глюкозидной природы (2), большинство их является производными тритерпенов, однако некоторые имеют стероидное строение (3).

На кровь in vitro сапонины действуют даже в больших разведениях гемолитиче­ским образом (2, 8). Экспериментальные работы показали, что при использовании сапонина как гемолитического агента в первую очередь разрушаются эритроциты, затем лейкоциты, лимфоциты и уже в последнюю очередь — опухолевые клетки, так как они наиболее резистентны к действию сапонина (5, 11, 15). В основе механизма гемолитического действия сапонинов лежит свойство их соединяться с липоидами клеток крови (3). Гемолитический индекс свыше 1500 обнаружен у следующих расте­ний: калужница перепончатая, воронец красноплодный, марь остистая, ломонос шестилепестковый, джефферсония сомнительная, девятисил японский, ломонос мань­чжурский, ломонос сизый, мыльный корень (2, 3). У некоторых же (качим метель­чатый, первоцвет, синюха лазурная) гемолитический индекс колеблется от 50 000 до 100 000 (3, 4).

Сырьем для сапонина может явиться любое из названных выше растений. Мы пользовались мыльным корнем, который применяется на меховых производствах. Приводим описание двух наиболее простых и эффективных способов получения сапонина:

1. Крупный порошок мыльного корня обрабатывается кипящим 95% этиловым спиртом, в горячем виде процеживается и оставляется на несколько суток при температуре -J- 10°. Образовавшийся осадок промывается холодным безводным спиртом эфиром и высушивается в теплом месте.

2. Измельченное сырье экстрагируют в аппарате Сакслета (объем 150—300 мл) метиловым спиртом в течение 16—20 часов. Затем растворитель отгоняют до 40— 50 мл. Остаток переносят в колбу емкостью 300 мл и туда же добавляют 200 мл эфира (осаждение сапонинов). Колбу закрывают корковой пробкой и содержимое перемешивают, после чего оставляют на холоде до следующего дня. Жидкость сли­вают, остаток эфира удаляют или в вакууме, или на водяной бане при температуре около 50°, осадок сушат при 100—105°.

При обоих способах получается аморфный порошок светло-желтого цвета, рас­творимый в воде и дающий при взбалтывании пену.

Был испытан метод выделения опухолевых клеток, основанный на гемолизе эритроцитов при помощи 1% раствора порошка, полученного из мыльного корня. На исследование брали кровь пациента из вены локтевого сгиба. 1% раствор сапонина добавляли из расчета 0,4 мл на 1 мл осадка после центрифугирования. Смесь вы­держивали 5 мин, вновь центрифугировали, жидкость над осадком отсасывали, оса­док промывали 0,85% раствором поваренной соли, после центрифугирования осадок переносили на предметное стекло и готовили мазок. Окраску проводили по Романов­скому-Гимза.

Произведено около 300 исследований крови у 184 больных различными опухоле­выми заболеваниями методом гемолиза при помощи 1% раствора сапонина. При сравнении гемолитической активности импортного препарата и полученного любым из указанных выше способов мы отличия в силе действия не обнаружили.

Преимущество сапонина перед стрептолизином заключается в том, что сапонин можно применять в опытах на животных, в то время как стрептолизин не действует на кровь животных гемолитически.