B. coli transformations in the intestine and bacteriophage

Abstract

Changes in the survival of bacteria from the destructive effects of the phage are based on their transformation into lyso-resistant races, against which a whole series of microbial variations with respect to morphological, cultural-biochemical, serological features and virulence are developed. Particularly numerous and varied studies are devoted to the variability influenced by the phage among the bacteria of the intestinal-typhose group, where its manifestations are most exclusive. Escherichia coli has been the subject of many observations.

Full Text

С бесспорностью доказано, что кишечный бактериофаг является мощным агентом микробной изменчивости (Бордэ, Брейнль, Ходер, Зонненшейн, Манингер, Куклова, Лейтнер, Гори, Ино, Грумбах и Димца, Клинебергер и др). В основе изменений уцелевающих от губительного действия фага бактерий лежит превращение их в лизорезистентные расы, на фоне которого развертывается целая серия микробных вариаций в отношении морфологических, культурно-биохимических, серологических признаков и вирулентности. Особенно многочисленные и разносторонние исследования посвящены изменчивости под влиянием фага среди бактерий кишечно-тифозной группы, где ее проявления наиболее эксквизитны. Объектом многих наблюдений была кишечная палочка.

Описанные изменения В. coli под влиянием бактериофага, сводятся к следующим явлениям: возникновению лактозодефективных и слизистых рас, образованию причудливых колоний (Flatterformen Гильдемейстера), появлению агглютинативного роста на жидких средах, серологическим видоизменениям и накоплению R—форм, обладающих более высокой вирулентностью (до 15 раз по Деланей) по сравнению с исходными S—формами.

Рядом исследователей (Гильдемейстер и Бертлейн, Травинский, Минкевич, Блюменталь, Грумбахи Димца, Алексина, Коржинская, Никольский и Островская) отмечено, что при кишечно-инфекционных заболеваниях, особенно в период реконвалесценции (в отличие от нормы) в стуле пациентов очень часто, нередко весьма обильно, появляются лактозодефективные варианты кишечной палочки, т. наз. бактерии рагасоlі (паратифоподобные бактерии по терминологии Гильдемейстера и Бертлейна и Травинского), которые при поверхностном исследовании могут быть смѳ- шаны с паратифозными бактериями. Высеваемые из faeces бактерии рагасоlі во многих случаях находятся в состоянии легко-подвижной модификации, давая бесцветные на ср. Эндо колонии только в первые сутки, которые затем перекрашиваются в центре их в интенсивно-темно-красный цвет и нередко проявляют признаки мутации, когда на фоне бесцветных материнских колонии через несколько суток роста образуются множественные приподнятые красные дочерние узелковые колонии (Кnopfen), рассев которых на ср. Эндо дает два вида колоний,—бесцветные типа рагасоlі и красные—типа coli. Короче, перед нами в последнем случае общеизвестный В. coli (рагасоlі) mutabile Нейссера и Массини.

Грумбахом и Димца, Минкевичем и Блюменталем было высказано предположение о том, что появление бактерий рагасоlі в стуле реконвалесцентов, совпадающее с периодом максимальной активности фага против микробов- возбудителей заболеваний, является результатом группового действия его на В. coli в силу присущей фагу мультивалентности и способности его к адаптации к другим, особенно родственным, видам бактерий.

Настоящее исследование представляет попытку экспериментальной проверки приведенного выше предположения. Нами были произведены две серии опытов: эксперименты in vitro и эксперименты in vivo.

Для опытов было взято 6 многократно (свыше 10 раз) расщепленных на чашках со средой Эндо штаммов типичного В. coli commune, выделенных из faeces здоровых людей, не содержавшие в себе фага, и бульон-фильтрат, содержавший бактериофаг анти-Шига, выделенный из faeces дизентерийного больного. Активность фага по отношению к гомологичному штамму палочки Шига равнялась титру 10—4 ¹). При непосредственном воздействии на введенные в опыт культуры В. coli: № 4, № 5, № 12, № 16 и № 23 наш исходный анти-Шига фаг никакого влияния не оказывал.

С целью адаптирования гетерогенного бактериофага к культурам В. coli было проведено 10 пассажей совместного культивирования штамма В. coli comm. № 1 с В. dysenteriae Shiga на бульоне в присутствии соответствовавшего последней культуре фага (анти-Шига). Ни в одном из пассажей со смешанной культурой полного лизиса бактерий отмечено не было. Фильтрат, полученный после 10-го пассажа, сохранил исходную силу (10—4) по отношению к штамму палочки Шига и оказался слабо активным к В. coli commune № 1.

Это позволило нам произвести дальнейшие наблюдения над действием адаптированного гетерогенного фага на культуры кишечной палочки в условиях продолжительного контакта с бактериями. Для этой цели в неразведенный фильтрат в пробирках (по 5 к. см фильтрата в каждой) было засеяно по 1 петле суточных агаровых культур каждого из 6-ти штаммов В. coli и посевы оставлены были при комнатной температуре. Контролем служили одновременные посевы культур на бульон одинакового с фильтратом pH. В высевах, произведенных через 5 суток на среду Эндо из пробирок опытного ряда, у всех штаммов В. coli были получены колонии 2-х типов: S и R. S—формы представляли обычные для В. coli резко красные колонии, а колонии формы R имели только бледно-розовую окраску, т. е. были ясно лактодефективными. Спустя 2—3 суток центр- бледно-розовых R—колоний, сосочкообразно приподнятый, приобретал резко-красную окраску при остававшейся почти бесцветной периферии. В контрольных пробирках с бульоном никаких изменений В. coli не наступало.

Полученные R—варианты с подавленной способностью к расщеплению лактозы культивировались далее на бульон-фильтрате с Шига-бактериофагом также в условиях комнатной температуры. Через 14 дней контакта R—культур с фагом в них были получены следующие дальнейшие изменения. При высевах на среду Эндо все R—штаммы развились в виде 2-х сортов R—колоний: светло-розовых и совершенно бесцветных. Однако, спустя 4—5 суток, центр колоний по-прежнему окрашивался в цвет фуксина. Контроль неизменно давал прежние результаты — рост только типичных красных колоний coli.

Полученные нестойкие лактозодефекивные варианты R по своему отношению к лактозе между собой различались лишь количественно большим или меньшим замедлением в ее разложении, некоторые в начале щелочили лакмусовое молоко (синее кольцо на пленке). У штаммов №№ 5 и 12 наблюдалось резкое ослизнение колоний при хранении посевов на чашках в условиях комнатной температуры, причем колонии окружались мощными слизистыми валами, имевшими полное сходство с валообразованием у В. paratyphi В Шотмюллера. Бульонные культуры штаммов '№№ 1, 16 и 23 резко спонтанно агглютинировались в виде рыхлых крупных хлопьев, оставляя бульон совершенно прозрачным. Наблюдалось также образование Flatterformen. Наконец, дальнейшие 3 пассажа штамма № 1 на бульонном фильтрате с адаптированным фагом Шига привели к появлению типичных мутирующих форм—В. coli (paraeoli) mutabile. Мутационные явления наблюдались в виде образования множественных характерных резко красных узелковых дочерних колоний на основной бесцветной материнской колонии, — рассев которых давал резко-красные и совершенно бесцветные колонии. Бесцветный вариант относился к типу В. paraeoli mutab. А по схеме Минкевича.

Таким образом, экспериментально in vitro под влиянием гетерогенного адаптированного к кишечной палочке слабо активного бактериофага (анти-Шига) нам удалось в условиях замедленного низкой температурой повторного воздействия на отбираемые варианты получить из типичного В. coli comm, модифицированные и мутирующие лактозодефективные разновидности paraeoli с общим сдвигом в сторону образования форм R и частично — слизистых рас.

Вторая серия наших опытов — воздействие гетерогенного фага на кишечную палочку in vivo—была поставлена на небольшой партии белых мышей, микрофлора кишечника которых, тщательно предварительно изученная, не содержала бактерий paraeoli и у которых в кишечнике спонтанный фаг к своим расам В. coli отсутствовал. Всего в опыт было включено 12 мышей: 6 подопытных и 6 контрольных. Мыши с помощью пастеровских пипеток получали повторно клизмы—подопытные—из фага анти Шига (не адаптированного к В. coli) с титром 10-⁵, контрольные— из бульона. Всего мышам сделано было по 12 клизм. У одной подопытной мыши к концу эксперимента удалось получить возникновение лактозодефективных вариантов с признаками расщепляющейся нестойкой модификации (бледные колонии с последующим образованием красных центров, при рассеве из которых вырастали красные и бесцветные колонии ¹); у 2-х подопытных мышей наблюдалось наводнение кишечника протеем (феномен Переищи?), при чем в одном случае протей нацело вытеснил кишечную палочку. Обе мыши дали легкие явления энтерита.

Возможно, что применение адаптированного к В. coli гетерогенного фага привело бы нас в опытах in vivo к еще более далеко идущим результатам.

Выводы:

1. Под влиянием гетерогенного бактериофага (анти-Шига) удалось экспериментально вызвать у типичного В. coli commune далеко идущие трансформации— до образования лактозодефективных и мутирующих рас coli mutabile включительно.
2. Возможность экспериментального получения естественно наблюдаемых трансформаций В. coli comm, в разновидности рагасоlі под воздействием гетерогенного бактериофага, по нашему мнению, подтверждает правильность допущения о причинной зависимости между появлением в организме бактериофага и возникновением бактерий рагасоlі при кишечных инфекционных заболеваниях.

¹) Титрация по Àппельману.

¹) При посеве на лакмусовое молоко — начальное щелочение (синее кольцо).