On the cultivation of spir. pallida on liquid culture media

Abstract

In recent years, great strides have been made on the cultivation of spirochetes, and if relatively simple and completely reliable methods of growing them in vitro on both solid and liquid nutrient media have been developed for a number of pathogenic and non-pathogenic spirochetes, then on the issue of With the cultivation of the pale spirochete, we are moving forward very slowly, and the successes achieved recently in this area must be recognized as very modest. 

Full Text

(С 2 рис.)

За последние годы в вопросе о культивировании спирохэт вообще сделаны большие успехи, и, если для целого ряда патогенных и непатогенных спирохэт разработаны сравнительно-несложные и вполне надежные методы выращивания их in vitro как на твердых, так и на жидких питательных средах, то в вопросе о культивировании бледной спирохэты мы идем вперед очень медленно, и успехи, достигнутые за последнее время в этой области, нужно признать очень скромными.

Главные работы Scheresсhеwsk’ого, Mühlens’а, Nogouchi, Hoffmann’а, разрешили с принципиальной точки зрения и в положительном смысле вопрос о возможности культивирования spir. pallida на искусственных питательных средах. Последующие работы Schmamine, Nakano, Tomaschewsk’ого, Baeslack’а, Arnheim’а, Sowade и др. касаются, главным образом, методов культивирования на твердых и полутвердых питательных средах и по преимуществу в условиях смешанной культуры; получение же чистой культуры, даже при этих условиях, является случайной редкостью и требует огромной затраты времени и труда.

В виду того, что твердые и полутвердые питательные среды представляют целый ряд неудобств для наблюдения и экспериментирования, естественно явилось стремление к разработке методов культивирования бледной спирохэты на жидких питательных средах, и в последнее время этот вопрос привлек к себе внимание целого ряда исследователей. Первыми, кому удалось получить чистую культуру sp. pallida на жидкой среде, был Nogouchi (Serumwasser+кусочек свежего яичка или почки кролика). Но насколько среда Nogouchi далека от идеала, можно судить по тому, что такому исследователю, как Mühlens, ни разу не удалось получить чистой культуры бледной спирохэты на этой среде. Попытки Uhlenhuth’а, Ungermann’а, Habermann’а получить чистую культуру на жидких средах кончились неудачей. Удачными за последнее время были в этом отношении опыты Wassermann’а и Ficker’а, которые сообщают о получении ими чистых культур как на жидких, так и на твердых питательных средах; к сожалению, авторы не сообщают состава своих питательных сред. Об удачных опытах сообщают также Saureguі и Lance1otti. Что касается исследований Krantz’а, произведенных в 1923—24 году, то, повидимому, здесь дело идет о смешанных культурах. Попытки же Grütz’а перевести полученные им на полусвернутой человеческой сыворотке 2 штамма бледной спирохэты на жидкие среды окончились неудачей.

Такое положение дела и побуждает нас сообщить результаты наших опытов получить чистую культуру spir. pallida на жидкой среде. Многочисленные попытки наши получить такую культуру, пользуясь исходным материалом, содержащим спирохэт в чистом виде (яичко кролика при орхите, сок из лимфатической сифилитической железы человека), кончились неудачей, несмотря на то, что для опытов своих мы пробовали применять все наиболее известные из предложенных жидких питательных сред. За последнее время мы взяли в качестве исходного материала смешанную культуру бледной спирохэты, которая у нас втечение уже 2 лет поддерживается в лаборатории на среде Schereschewsk’ого и которая была получена при посеве на эту среду кусочка сифилитической папулы человека. Наблюдая от генерации к генерации за соотношением между количеством сопровождающих бактерий и спирохэт, мы подметили, как это соотношение постепенно меняется в пользу последних. Выбирая для посевов культуры наиболее богатые спирохэтами и бедные посторонними бактериями, мы достигли того, что в некоторых участках среды спирохэты развивались в чистой культуре. Однако пересевы из таких участков снова на среду Schereschewsk’ого с целью получения на этой среде чистой культуры заканчивались неудачей: спирохэты в чистом виде не росли на среде Schereschews’ого. Точно также кончились неудачей пересевы со среды Schereschewsk’ого на жидкие среды, предложенные другими авторами.

Тогда мы сделали попытку приготовить свои среды. Первые ободряющие результаты мы получили при применении кроличьей инактивированной сыворотки (1 час при 60°) с прибавлением свежего кусочка яичка или мозговой ткани кролика. В дальнейшем при замене в этих средах кроличьей сыворотки сывороткой лошади мы получили отрицательные результаты. Наоборот, замена кроличьей сыворотки некоторыми сортами асцита привела к получению очень богатых культур.

Так как наши наблюдения над средами с асцитом показали, что успех зависит от каких-то ближе нам неизвестных свойств асцитической жидкости (количество белка? примесь желчи?), а в то же время с несомненностью указывали на преимущество удачно подобранной асцитической жидкости перед кроличьей сывороткой, то мы применили для изготовления наших питательных сред человеческую инактивированную сыворотку. Наблюдения наши показали, что такая сыворотка вполне может заменить хорошую асцитическую жидкость. Мало того, — оказалось, что особенно пригодной является человеческая сыворотка, полученная из плацентарного конца пуповины.

В конечном итоге мы в настоящее время остановились на следующей методике изготовления жидкой среды: гретая сыворотка человеческой крови, полученной из плацентарного конца пуповины, разводится физиологическим раствором NaCl в отношении 1:2; на дно проборки опускается кусочек свежей мозговой ткани или свежего яичка кролика; т. к. технически легче получить стерильно и в большем количестве мозг кролика, чем яичко, то мы готовим среды по преимуществу с кусочками мозговой ткани. После засева пробирка с жидкой средой заливается расплавленным. вазелином. Выращивание производится при 35° С. Maximum развития культуры достигается при этом в различные сроки — от 3—4 до 7—8 дней. На этой среде мы имеем чистую культуру бледной спирохэты, проделавшую на ней к настоящему времени свыше 75 генераций.

Наши наблюдения показывают, что культивирование бледной спирохэты на жидкой среде в чистом виде до настоящего времени остается делом очень трудным и кропотливым, и, если нам удалось в результате проделанной большой работы добиться получения чистой культуры на нашей питательной среде, то мы, конечно, далеки от мысли считать метод, которым мы пришли к получению чистой культуры, вполне удовлетворительным. Трудности, которые стоят на пути выработки простого и надежного метода, относятся к двум моментам. Прежде всего это — получение первой генерации спирохэт от больного человека или животного. Нужно сказать, что эта задача сравнительно нетрудно решается в случае, если дело идет о получении смешанной культуры на среде Schereschewsk’ого. Сопровождающие микроорганизмы несомненно при этом имеют благоприятное влияние на условия роста спирохэт, и, вероятно, роль этих микроорганизмов сводится к расщеплению питательного субстрата среды, неспособного непосредственно служить для питания спирохэт и к накоплению в среде продуктов ферментативного распада белковых тел, легко усвояемых спирохэтами и т. о. обеспечивающих их существование. В условиях такого сожительства спирохэты в ряде генераций успевают постепенно приспособиться к жизни на искусственных питательных средах, приобретают способность разлагать более сложные питательные вещества и т. о., в конце концов, обходиться без помощи сопровождающих микроорганизмов. Вот тогда-то и наступает удобный момент для выделения спирохэт в чистой культуре, что мы наблюдаем и в нашем случае. Насколько spir. pallida может стать нетребовательной к питательному субстрату, показывают наблюдения Krantz’а, который выращивал спирохэт в 0,5% растворе мочевины.

Другим трудным моментом является выделение спирохэт в чистом виде из смешанной культуры. До сего времени здесь нет простого и надежного метода, и дело продолжает носить случайный характер. Казалось-бы, что выход из положения можно найти в применении в качестве исходного материала для посевов тех патологических продуктов, где бледная спирохэта находится уже в чистом виде. Наши наблюдения, однако, убедили нас, что спирохэты такого происхождения являются чрезвычайно требовательными к условиям выращивания их in vitro, и те питательные среды, на которых обильно размножаются спирохэты в смешанной культуре, или спирохэты, успевшие приспособиться к жизни in vitro, являются непригодными для развития в чистом виде спирохэт, непосредственно происходящих от больного организма. Но разработка именно такого прямого метода нам кажется в дальнейшем наиболее желательной, т. к. при этих условиях обеспечивается больше всего получение культуры сифилитических спирохэт с теми свойствами и особенностями, которые присущи этим спирохэтам, когда они находятся в тканях больного организма. Наоборот, при получении чистой культуры спирохэт из смешанной больше всего грозит опасность, что выделенная в конце концов чистая культура, проделавшая предварительно ряд мытарств на искусственных питательных средах, окажется лишенной многих из тех свойств, которые ей присущи в организме больного, и которые для нас особенно ценны.

Рис. 1. 4-дневная культура spir. pallida в жидкой среде. Dunkelfeldbeleuchtung. Ок. Leitz’a № 4, об. Leitz’a № 6a.

Abb. № 1. 4-tagige Kultur der sp. pallida in fluss. Nährboden. Dunkelfeldbeleuchtung. Okul. Leitz № 4, Ob. Leitz № 6a.

Рис. 2. Та же культура. Мазок, фиксир. метил. алкоголем, окраш. по. Giemsa. Ок. comp. Zeiss’a № 6, об. Zeiss’a 2 mm.

Abb. № 2. Dieselbe Kultur. Ausstrichpräparat, Fixierung mit Methylalcohol, Färbung nach Giemsa. Okul. comp. Zeiss № 6, Ob. Zeiss 2 mm.

Prof. W. M. Arijstowsky und I)-r R. R. Hoeltzer (Kasan). Heber die Kultivierung der spiroch. pallida in flüssigen Nährböden.

Nach vielen misslungenen Versuchen die Kultur der spiroch. pallida auf bekannten flüssigen Nährböden aus einer Mischkultur nach Scheresellewsky zu bekommen, gelang es den Autoren eine Reinkultur auf dem flüssigen, von ihnen zusammengesetzten Nährboden zu erhalten. Dieser Nährboden besteht aus inaktivierten Menschensernm, am besten vom Blute aus der Placentarende des Nabelschnurs gewonnen, mit 2 Teile physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und mit Zusatz eines Stückchens frischen Gehirngewebe oder Hoden vom Kaninchen. Die beimpften Röhrchen werden mit geschmolzenen Vaselin überschichtet. Züchtung bei 35° C. Maximum der Entwieckelung am 3—5 oder 7—8 Tage. Auf diesen Nährboden hat der Stamm der spiroch. pallida in Reinkultur zur Zeit mehr als 75 Generationen durchgemacht.