Experiments in the cultivation of typhus virus

Abstract

The subject of this communication is 1) the results of observations on further experiments on growing the typhus virus in yeast cultures, 2) data on the study of the action of immune sera obtained during immunization with the culture virus, and 3) experiments on vaccination of guinea pigs and rabbits with the same virus.

Full Text

Предметом настоящею сообщения являются во 1) результаты наблюдений над дальнейшими опытами выращивания сыпнотифозного вируса в к-рах дрожжей, во 2) данные изучения действия иммунных сывороток, полученных при иммунизации культуральным вирусом и в 3) опыты вакцинации этим же вирусом морских свинок и кроликов.

Опыты выращивания вируса.

Как было указано в первой нашем сообщении ²) нами были получены к-ры (I и II шт.) сыпнотифозного вируса по методу Зильбера и Доссер в к-рах дрожжей, причем мы пользовались для этой цели культурами Saccharomyces cerevisiae расы М и II. Заражая этими к-рами в 15, 16, 19 и 20 генерациях м. свинок и кроликов, мы могли установить, что в этих к-рах действительно содержится вирус, но этот вирус, повидимому, ослабленный, т. к. у морских свинок лихорадка протекала не типично и у кроликов титр сыворотки в отношении р. Weil-Felix’a в среднем не превышал 1 :20.

Продолжая опыты выращивания сыпнотифозного вируса, мы поставили себе целью изучение дальнейших изменений вируса и затем для сравнительной оценки пригодности различных питательных сред был произведен ряд новых посевов крови от сыпнотифозных больных на Готтингеровский бульон, мясопептонный бульон с pH 7,2 и 7,6, кроме того, мы применили наряду с дрожжами Saccharomyces cerevisiae р, М и II еще кефирные дрожжи, т. е. тот вид дрожжей, который был применен для получения к-р сыпнотифозного вируса Зильбером и Доссер. Для кефирных дрожжей, кроме перечисленных сред был взят еще мясопептонный бульон pH 7,2 с 0,5% лактозы.

Таким образом нами были получены еще к-ры III, IV и V штаммов. Посев крови производился от больных на 14 день болезни (III и IV шт.) и на 9 день болезни (V шт.) Выращивание к-р при 36°—37°, пересевы обычно на 7—8 сутки.

Для определения вируса в к-рах начальных генераций производилось заражение м. свинок подкожно 2 к.с. к-ры, а в позднейших генерациях 4—5 к. с,; кроликам для выявления агглютининов в отношении b. Proteus Х₁₉ вводилось интравенозно от 3,5 до 5 к. с. к-ры. Наряду с заражением к-рами одновременно, с целью контроля, как морским свинкам, так и кроликам, вводились в том же количество к-ры одних дрожжей и кроме того контрольные посевы крови на средах без дрожжей в соответствующей к-ре вирусных дрожжей генерации.

Заражение к-рами различных штаммов было произведено в след. генерациях:

• штамм к-ры 34 генер.
• . 33      „          и   36  генер.
• „ „           6      „          „    18      „
• . .22                „
• „ „6                 „

Все эти опыты были поставлены на 64 м. св. и 32 кроликах.

При рассмотрении температурных кривых зараженных м. св. необходимо отметить, что на 1—3 день у большей части свинок t° повышается и держится обычно не более 1—2 суток, причем это повышение достигает иногда до 40°. Так как такое же повышение t° можно было наблюдать иногда и у контрольных животных, которым была введена к-ра одних дрожжей, то этот подъем t° можно объяснить как реакцию у некоторых свинок на введенные дрожжи. Инъекция одной питательной среды без дрожжей (пересевы контрольных посевов крови) не вызвала изменений t°.

Сначала мы остановимся на рассмотрении температурных кривых м. св., зараженных к-рами III и V штаммов в 6-й генерации.

Независимо от примененной из указанных выше питательных сред и вида дрожжей (в том числе и кефирных) повышение t° отмечалось начиная от 6—22 дня с момента заражения, чаще на 9—12 день: продолжительность периода лихорадки составляла обычно 5—у суток, чаще 5 суток, колебания t° происходили в пределах от 0,3° до 1,3°, причем максимальная температура держалась обычно не долее 2—3 дней. Температура не превышала 39,6°. Таким образом в опытах заражения и с к-рами III и V штаммов, подобно опытам с I и II штаммами, мы не могли отметить развития типичной для сыпного тифа лихорадки. Во всех случаях заражения отмечалось падение веса от 5,0 до 40,0. Результаты опытов заражения кроликов этими же к-рами (представлены в табл. 1), которые нам дали положительную реакцию Weil- Felix'a, позволяют допустить, что это повышение t° у морских свинок все же вызвано содержащимся в дрожжевых к-рах вирусом.

Из данных этой таблицы видно, что у кроликов, зараженных к-рами в 6-й генерации обоих штаммов, выращиваемых как с дрожжами р. М и II, так и с кефирными, появились агглютинины в отношении b. Proteus Х₁₉ с титром 1:50. При заражении контрольными посевами крови соответствующих генераций и при заражении к-рами одних дрожжей, образование агглютининов или вовсе не отмечается или же р. Weil- Fe1іх'а наблюдается при разведении сыворотки не более 1:5.

Таким образом, на основании этих положительных данных, мы можем допустить наличие вируса в наших к-рах, при чем из этих опытов следует, что для выращивания вируса, как кефирные дрожжи, так и дрожжи Saccharomyces cerevisiae р. М и р. II являются равноценными.

Последующие опыты, с целью выяснения дальнейшего состояния сыпнотифозною вируса в к-рах дрожжей были нами произведены с к-рами всех пяти штаммов уже в более поздних генерациях, при этом наряду с заражением 2 к. с. к-ры была применена и более высокая доза в 4—5 к. с., так как мы полагали, что быть может при увеличении количества вируса удастся получить типичную лихорадку у м. св. Однако, при заражении к-рами 18-й генерации (III шт.) 22 генер. (IV и V шт.), 33 и 36 генер. (П шт.) и 34 генер. (I шт.), мы не могли отметить даже и при введении к-р в количестве 5 к. с. развития типичной лихорадки. Иногда на 7—12 день наблюдался подъем t° на 0,5—1,2°, а на след. день или через день t° снова становилась нормальной. Кроме того и некоторые из контрольных м. св. при введении им к-ры одних дрожжей дав ли более длительные колебания t°, причем t° достигала иногда до 40°, что, вероятно, объясняется инъекцией значительного количества дрожжей; одновременно с заражением м. св. производилось заражение кроликов для выявления агглютининов к b. Proteus Х₁₉; однако, все эти опыты (см. табл. 1) дали отрицательные результаты. Опыты заражения контрольными посевами в таблицу не включены. Одни из опытов заражения к-рой ІII штам. 18 генер. вирусными кефирными дрожжами (ІII—130/18) дал слабо-положительную (+) реакцию Weil-Felix’a при разведении сыворотки 1:5 (кролик № 304), но результат этой реакции не может быть принят во внимание, так как иногда контрольные кролики при инъекция одних дрожжей давали аналогичный результат (см. 1-е сообщение).

Таким образом, на основания этих данных, мы приходим к выводу, что во всех указанных к-рах сыпно-тифозного вируса не оказалось. Итак, по мере дальнейшего выращивания в дрожжевых к-рах вирус исчезает и если мы обратимся к данным опытов заражения к-рами I и II штаммов в 19, 20 и 24 генерац. когда эти опыты дали нам положительную р. Weil-Felix’a (см. сообщение 1) и сопоставим с опытами заражения к-рами III, IV и I штаммов, то увидим, что жизнеспособность этого вируса у наших штаммов различна, так, исчезновение вируса нами обнаружено: у I шт. в 34 генер., II шт. в 33 генерации, III шт. в 18 генер. и у IV шт. в 22 генер. На основании этих опытов, мы должны сделать вывод, что при выращивании в к - рах дрожжей сыпно - тифозный вирус сохраняется в ограниченном числе генераций, причем вирус даже и в начальных генерациях не дает у м. св. вполне типичной лихорадки.

Опыты, иммунизации культуральным вирусом.

Для выяснения возможности получения иммунных сывороток при помощи культурального вируса и для изучения полученных таким образом сывороток, нами было приступлено к иммунизации лошади, теленка и барана 13 декабря 1933 года.

Для иммунизации была взята к-ра II штамма в 24-й генерации на дрожжах Saccharomyces cerevisiae раса М. Культуры вводились три дня подряд, каждый раз одновременно интравенозно, внутримышечно и подкожно. Лошади (в. т. 400 кило) введено по 1 литру интравенозно и по 500 кс. внутримышечно и подкожно. Телке № 1 (в. т. 85 кило) по 200 к.с. интравенозно, по 125 к.с, внутримышечно и по 100 к. с. подкожно; барану № 1 (в. т. 18 кило) по 45 к.с. в вену, по 25 к.с. внутримышечно и по 20 к.с. под кожу. Для контроля был проиммунизирован таким же образом баран № 2 к-рой одних дрожжей р. М. (без вируса). До иммунизации сыворотки этих животных были исследованы на присутствие нормальных агглютининов в отношении b. Proteus Х₁₉ (Н и О формы), так как известно (Wei1 и Вreinl), что нормальные сыворотки лошади, барана и быка дают положительную реакцию с b Proteus X_J9 в разведениях до 1 :200 (сыворотка лошади 1:200,— барана 1:10,—быка 1 : 50).

У наших животных эта реакция была получена с сыворотками лошади й телки при разведении не выше 1:100, с сывороткой барана № 1 при разведении не выше 1 : 50, а у барана № 2 — 1 :100 (см. таб. 2).

После введения вирусных дрожжей у всех животных можно было отмстить сильно выраженную температурную реакцию (на след. день t° 41, причем высокая температура в пределах от 40° до 41° держалась в течение 2-х дней, а затем пала до нормы. Такую же реакцию можно было наблюдать и у барана № 2, которому была введена к-ра одних дрожжей.

На 14-й день и 30-й день после третьей инъекции сыворотки всех животных испытывались на присутствие агглютининов к Proteus Х₁₉ Результаты этих опытов (см. табл. № 2) указывают на значительное повышение титра агглютинации. Так, сыворотка дала слабо-положительную р. (+) при разведении 1:800 на 14 день, и положительную р. (++) при разведении 1:1200 на 30-й день; сыворотка телки положительную реакцию при разведении 1:400 на 14 день и слабо положительную при разведении 1: 1200 на 30 день, а сыворотка барана № 1 на 14 день дала положительную реакцию при разведении ее 1:400 и в той же степени реакцию при разведении 1 : 1200 на 30 день; в разведениях меньших все эти сыворотки дали резко положительную реакцию ( +++).

Титр сыворотки контрольного барана № 2, иммунизированного одними дрожжами, оказался неизмененным и не превышая 1:10.

Таким образом повышение титра сыворотки животных, обработанных вирусными дрожжами, мы должны объяснить влиянием вируса, находящегося в дрожжевых культурах. Через месяц после Зй инъекции к-р телка и баран № 1 были обескровлены, а у лошади были произведены 3 кровопускания с промежутком в один день. У барана № 2 (контрольн.) кровь была взята также через месяц.

В дальнейшем полученные сыворотки инактивированные и не нагретые, все с прибавлением 0,5% хлороформа были испытаны в отношении вирулицидных свойств и лечебных на морских свинках.

Опыты изучения вирулицидных свойств ставились следующим образом: 5 к.с. сыворотки смешивались с 1 к.с. вирусного мозга (1 :20) м. св., зараженной пассажным вирусом, полученный нами в 1933 г. заражением м. св. кровью больного сыпным тифом и проделавшим к моменту этих опытов 13 пассажей. Для характеристики пассажного вируса необходимо отметить, что при внутрибрюшинном введении 1/20 мозга, взятого на 3—4 день лихорадки, превышение t° обычно появлялось на 4—7 день и лихорадка продолжалась в течение 10 — 12 дней.

Смесь сыворотки и вируса выдерживалась 2 часа при t° 36° и тотчас же вводилась в брюшную полость м. св. В качество контрольных опытов вводилась смесь: во 1) 1 к.с. вир. мозга (1 :20) 4-5 к.с. физиолог. раствора NaCl, сохранявшееся с хлороформом в количество 0,5%, и во 2) смеси 1 к. с. вир. мозга (1 :20) + нормальная сыворотка лошади, барана, толки. Все эти смеси также выдерживались 2 часа при 36°.

В ряде случаев, когда введение смеси вируса и сыворотки не вызывало появления лихорадки, через 2 месяца со времени введения смеси, производилось повторное заражение 1/20 вирусного мозга интраперитонеально, для исключения рефрактэрности этих м. свинок к сыпнотифозной инфекции. Результаты всех этих опытов приведены в нижеслед. таблице: Таблица № 3.

Все иммунные сыворотки, испытанные на 42 день их хранения, предотвратили развитие лихорадки (температ. кривые см. ниже) и при повторном заражении м. свинок одним вирусом появлялась типичная лихорадка на 4 —8 день. При испытании нормальных сывороток и сыворотки барана (№ 2), проиммунизированного культурой одних дрожжей без вируса, наступало, как правило, развитие типичной лихорадки на 5—9 день, при этом необходимо отметить, что в большом ряде случаев применялись сыворотки более свежие (11—19 дней с момента получения) нежели сыворотки иммунные и только в 4-х случаях сыворотки, хранившиеся 40 дней. В 4 - х случаях развития лихорадки не наступало и в 1 случае наблюдалось повышение t° в виде однодневного приступа на 11 день. Все эти 5 случаев касаются исключительно опытов с ненагретыми нормальными сыворотками. При повторном заражении 2 м. св. из этой группы наблюдалась лихорадка укороченная (в теч. 6 дней), что дает возможность сделать предположение о неполном исчезновении вируса в смеси и в таком случае возможно допустить—при заражении смесью ненагретой нормальной сыворотки с вирусом, развитие скрытой инфекции. При действии же иммунной сыворотки на вирус во всех случаях, как было отмечено выше, повторное заражение вызывало появление длительной лихорадки.

Ввиду того, что в опытах с нормальными сыворотками, а именно с ненагретыми сыворотками, отмечаюгся вирулицидные свойства последних, мы должны в опытах с иммунными сыворотками учитывать только те результаты, которые были получены с иагретыми сыворотками. Контрольные опыты с инактивированными нормальными сыворотками (8 случаев) и с инактивированными сыворотками барана (№ 2), иммунизированною чистой к-рой дрожжей (без вируса), в 8 случаях дали типичную лихорадку и в одном только случае—укороченную (оп. с нормальной инактивирован. лошад. сывор. № 3). Температурные кривые м. свин., зараженных смесью вируса с инактивированной иммунной сывороткой,—см. стр. № 92.

Таким образом, на основании результатов опытов испытания вирулицидных свойств сывороток, полученных от лошади, барана и телки, про- иммунизированных вирусными дрожжами, мы можем сделать вывод, что эти сыворотки действительно обладают вирулицидными свойствами в отличие от сывороток нормальных. Применяя, хотя и ослабленный, благодаря выращиванию в к-ре дрожжей сыпно-тифозный вирус, возможно получение иммунных сывороток. Однако, сила этих сывороток оказывается еще незначительной, так как при постановке опытов с иммунными сыворотками (в объеме 5 кс.), сохранившимися в течение 60 дней, вирулицидные свойства уже не могли быть установлены. Одновременно с опытами по определению вирулицидных свойств, эти же сыворотки были применены на м. св., с целью изучения влияния их на течение инфекции. Но ввиду того, что в этом отношении сыворотки оказались малодеятельными, мы отказались от дальнейшего их применения. Всего было поставлено 8 опытов с сыворотками лошади, телки и барана. Морским свинкам, зараженным интраперитонеально 1/20 вир. мозга, в тот же день вводилось подкожно 5 к. с. иммунной сыворотки (сообщение В. Елина и Э. Френкмана об успешных опытах лечения сыпного тифа м. св. сывороткой реконвалесцентов при условии 3-кратного введения сыворотки еще не было опубликовано). Какого-либо резкого влияния на течение инфекции сыворотки не оказали. Можно было отметить только некоторое удлинение инкубационного периода, снижение лихорадки и укорочение ее в некоторых случаях до 6 дней по сравнению с контрольными м. св., не обработанными и теми, которым была введена в том же количестве нормальная сыворотка.

Рис. 1-3

Нам кажется, что применяя вирус менее измененный, т. е. пользуясь к-рами ранних генераций, возможно будет получить и более действенные сыворотки.

Опыты вакцинации культуральным вирусом.

Для опытов изучения вакцинирующих свойств убитых вирусных дрожжей, (к ра II шт, 22 генер. с Saccharomyces сеrеѵ., раса М) применялись к-ры, убитые во 1) нагреванием при 50° в теч. 40 мин., 2) действием 0,2% формалина в теч. 2 суток при 36°, 3) добавлением 0,5% ас. carbol, и в 4) прибавлением 0,5% хлороформа. Все вакцины применялись концентрированными в 10 раз. Вакцинации подверглись 8 м. св. и 4 кролика (по 2 м. св. и 1 кролику каждой вакциной).

Инъекции производились подкожно с промежутком в 5 дней—м. св. в дозе: 0.2, 0,4 и 0,6 к.с, а кроликам по 0,4, 0,8 и 1,2 к.с. У кроликов до вакцинации исследовалась кровь на р. Wеі1 - Felіх’а. У м. св. после 2 и 3 инъекции наблюдалось однодневное повышение t° от 0,5 до 1,0° и в месте впрыскивания вакцины — небольшие, довольно плотные инфильтраты.

При исследовании крови кроликов на р. W.-F. в периоде вакцинации появление агглютининов к b. proteus отмечалось у кроликов, обрабонанных нагретой, формалинизированной и карболизированной вакциной.

Через 1 месяц тонеально после 3-й инъекции м.св. были заражены интраперитонеально 1/15, а три кролика подкожно 1/5 вирусного мозга (кролик вакциниров. хлороформ. вакциной погиб от случайной инфекции до заражения вирусом), одновременно для контроля были заражены соответствующими дозами 2 нормальных м. св. и один кролик. О развитии инфекции у кроликов мы судим по р Weil-Felix’a. Что касается м.св,, то все они дали типичную лихорадку, а появление агглютининов к b. proteus X₁₉ было отмечено лишь у кролика, иммунизированною нагретой вакциной и у контрольною, у кроликов же, вакцинированныя формалинизированными и карболизированными вирусными дрожжами, титр р. Weil- FeІіх’а не только повысился, а наоборот, положительная реакция W.-F., наблюдавшаяся после вакцинации, перешла в отрицательную с OХ₁₉ и в слабоположительную с ОХ₁₉. Для иллюстрации изменений р. W.-F. у кроликов мы приводим таблицу.

О. р. не ставилась.

Казалось бы, что судя по этим данным можно было бы сказать, что у кроликов 338 и 242, обработанных формалиновой и карболизированной вакцинами заражение вирусом не вызвало появления инфекции, но ввиду малого количества опытов, мы воздерживаемся от окончательных выводов.

На основании всех приведенных нами опытов по выращиванию сыпнотифозною вируса в дрожжевых культурах и опытов иммунизации культуральным вирусом животных, мы позволяем себе сделать следующие выводы:

1) Для выращивания сыпно-тифозного вируса из крови людей, больных сыпным тифом, возможно применение наряду с кефирными дрожжами и дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

2) Метод выращивания вируса в дрожжевых к-рах дает возможность сохранения вируса в ограниченном числе генераций, причем даже и в начальных генерациях такой вирус не вызывает у м. свинок вполне типичной лихорадки.

3) При иммунизации животных (лошадь, теленок, баран) культуральным вирусом возможно получение иммунных сывороток, обладающих ясно выраженными вирулицидными свойствами.

²) См. Казанск. мед. жур. 1934 г., № 11—12.