Опыты культивирования сыпнотифозного вируса

Аннотация

Предметом настоящею сообщения являются во 1) результаты наблюдений над дальнейшими опытами выращивания сыпнотифозного вируса в к-рах дрожжей, во 2) данные изучения действия иммунных сывороток, полученных при иммунизации культуральным вирусом и в 3) опыты вакцинации этим же вирусом морских свинок и кроликов.

Полный текст

Опыты выращивания вируса.

Как было указано в первой нашем сообщении ²) нами были получены к-ры (I и II шт.) сыпнотифозного вируса по методу Зильбера и Доссер в к-рах дрожжей, причем мы пользовались для этой цели культурами Saccharomyces cerevisiae расы М и II. Заражая этими к-рами в 15, 16, 19 и 20 генерациях м. свинок и кроликов, мы могли установить, что в этих к-рах действительно содержится вирус, но этот вирус, повидимому, ослабленный, т. к. у морских свинок лихорадка протекала не типично и у кроликов титр сыворотки в отношении р. Weil-Felix’a в среднем не превышал 1 :20.

Продолжая опыты выращивания сыпнотифозного вируса, мы поставили себе целью изучение дальнейших изменений вируса и затем для сравнительной оценки пригодности различных питательных сред был произведен ряд новых посевов крови от сыпнотифозных больных на Готтингеровский бульон, мясопептонный бульон с pH 7,2 и 7,6, кроме того, мы применили наряду с дрожжами Saccharomyces cerevisiae р, М и II еще кефирные дрожжи, т. е. тот вид дрожжей, который был применен для получения к-р сыпнотифозного вируса Зильбером и Доссер. Для кефирных дрожжей, кроме перечисленных сред был взят еще мясопептонный бульон pH 7,2 с 0,5% лактозы.

Таким образом нами были получены еще к-ры III, IV и V штаммов. Посев крови производился от больных на 14 день болезни (III и IV шт.) и на 9 день болезни (V шт.) Выращивание к-р при 36°—37°, пересевы обычно на 7—8 сутки.

Для определения вируса в к-рах начальных генераций производилось заражение м. свинок подкожно 2 к.с. к-ры, а в позднейших генерациях 4—5 к. с,; кроликам для выявления агглютининов в отношении b. Proteus Х₁₉ вводилось интравенозно от 3,5 до 5 к. с. к-ры. Наряду с заражением к-рами одновременно, с целью контроля, как морским свинкам, так и кроликам, вводились в том же количество к-ры одних дрожжей и кроме того контрольные посевы крови на средах без дрожжей в соответствующей к-ре вирусных дрожжей генерации.

Заражение к-рами различных штаммов было произведено в след. генерациях:

• штамм к-ры 34 генер.
• . 33      „          и   36  генер.
• „ „           6      „          „    18      „
• . .22                „
• „ „6                 „

Все эти опыты были поставлены на 64 м. св. и 32 кроликах.

При рассмотрении температурных кривых зараженных м. св. необходимо отметить, что на 1—3 день у большей части свинок t° повышается и держится обычно не более 1—2 суток, причем это повышение достигает иногда до 40°. Так как такое же повышение t° можно было наблюдать иногда и у контрольных животных, которым была введена к-ра одних дрожжей, то этот подъем t° можно объяснить как реакцию у некоторых свинок на введенные дрожжи. Инъекция одной питательной среды без дрожжей (пересевы контрольных посевов крови) не вызвала изменений t°.

Сначала мы остановимся на рассмотрении температурных кривых м. св., зараженных к-рами III и V штаммов в 6-й генерации.

Независимо от примененной из указанных выше питательных сред и вида дрожжей (в том числе и кефирных) повышение t° отмечалось начиная от 6—22 дня с момента заражения, чаще на 9—12 день: продолжительность периода лихорадки составляла обычно 5—у суток, чаще 5 суток, колебания t° происходили в пределах от 0,3° до 1,3°, причем максимальная температура держалась обычно не долее 2—3 дней. Температура не превышала 39,6°. Таким образом в опытах заражения и с к-рами III и V штаммов, подобно опытам с I и II штаммами, мы не могли отметить развития типичной для сыпного тифа лихорадки. Во всех случаях заражения отмечалось падение веса от 5,0 до 40,0. Результаты опытов заражения кроликов этими же к-рами (представлены в табл. 1), которые нам дали положительную реакцию Weil- Felix'a, позволяют допустить, что это повышение t° у морских свинок все же вызвано содержащимся в дрожжевых к-рах вирусом.

Из данных этой таблицы видно, что у кроликов, зараженных к-рами в 6-й генерации обоих штаммов, выращиваемых как с дрожжами р. М и II, так и с кефирными, появились агглютинины в отношении b. Proteus Х₁₉ с титром 1:50. При заражении контрольными посевами крови соответствующих генераций и при заражении к-рами одних дрожжей, образование агглютининов или вовсе не отмечается или же р. Weil- Fe1іх'а наблюдается при разведении сыворотки не более 1:5.

Таким образом, на основании этих положительных данных, мы можем допустить наличие вируса в наших к-рах, при чем из этих опытов следует, что для выращивания вируса, как кефирные дрожжи, так и дрожжи Saccharomyces cerevisiae р. М и р. II являются равноценными.

Последующие опыты, с целью выяснения дальнейшего состояния сыпнотифозною вируса в к-рах дрожжей были нами произведены с к-рами всех пяти штаммов уже в более поздних генерациях, при этом наряду с заражением 2 к. с. к-ры была применена и более высокая доза в 4—5 к. с., так как мы полагали, что быть может при увеличении количества вируса удастся получить типичную лихорадку у м. св. Однако, при заражении к-рами 18-й генерации (III шт.) 22 генер. (IV и V шт.), 33 и 36 генер. (П шт.) и 34 генер. (I шт.), мы не могли отметить даже и при введении к-р в количестве 5 к. с. развития типичной лихорадки. Иногда на 7—12 день наблюдался подъем t° на 0,5—1,2°, а на след. день или через день t° снова становилась нормальной. Кроме того и некоторые из контрольных м. св. при введении им к-ры одних дрожжей дав ли более длительные колебания t°, причем t° достигала иногда до 40°, что, вероятно, объясняется инъекцией значительного количества дрожжей; одновременно с заражением м. св. производилось заражение кроликов для выявления агглютининов к b. Proteus Х₁₉; однако, все эти опыты (см. табл. 1) дали отрицательные результаты. Опыты заражения контрольными посевами в таблицу не включены. Одни из опытов заражения к-рой ІII штам. 18 генер. вирусными кефирными дрожжами (ІII—130/18) дал слабо-положительную (+) реакцию Weil-Felix’a при разведении сыворотки 1:5 (кролик № 304), но результат этой реакции не может быть принят во внимание, так как иногда контрольные кролики при инъекция одних дрожжей давали аналогичный результат (см. 1-е сообщение).

Таким образом, на основания этих данных, мы приходим к выводу, что во всех указанных к-рах сыпно-тифозного вируса не оказалось. Итак, по мере дальнейшего выращивания в дрожжевых к-рах вирус исчезает и если мы обратимся к данным опытов заражения к-рами I и II штаммов в 19, 20 и 24 генерац. когда эти опыты дали нам положительную р. Weil-Felix’a (см. сообщение 1) и сопоставим с опытами заражения к-рами III, IV и I штаммов, то увидим, что жизнеспособность этого вируса у наших штаммов различна, так, исчезновение вируса нами обнаружено: у I шт. в 34 генер., II шт. в 33 генерации, III шт. в 18 генер. и у IV шт. в 22 генер. На основании этих опытов, мы должны сделать вывод, что при выращивании в к - рах дрожжей сыпно - тифозный вирус сохраняется в ограниченном числе генераций, причем вирус даже и в начальных генерациях не дает у м. св. вполне типичной лихорадки.

Опыты, иммунизации культуральным вирусом.

Для выяснения возможности получения иммунных сывороток при помощи культурального вируса и для изучения полученных таким образом сывороток, нами было приступлено к иммунизации лошади, теленка и барана 13 декабря 1933 года.

Для иммунизации была взята к-ра II штамма в 24-й генерации на дрожжах Saccharomyces cerevisiae раса М. Культуры вводились три дня подряд, каждый раз одновременно интравенозно, внутримышечно и подкожно. Лошади (в. т. 400 кило) введено по 1 литру интравенозно и по 500 кс. внутримышечно и подкожно. Телке № 1 (в. т. 85 кило) по 200 к.с. интравенозно, по 125 к.с, внутримышечно и по 100 к. с. подкожно; барану № 1 (в. т. 18 кило) по 45 к.с. в вену, по 25 к.с. внутримышечно и по 20 к.с. под кожу. Для контроля был проиммунизирован таким же образом баран № 2 к-рой одних дрожжей р. М. (без вируса). До иммунизации сыворотки этих животных были исследованы на присутствие нормальных агглютининов в отношении b. Proteus Х₁₉ (Н и О формы), так как известно (Wei1 и Вreinl), что нормальные сыворотки лошади, барана и быка дают положительную реакцию с b Proteus X_J9 в разведениях до 1 :200 (сыворотка лошади 1:200,— барана 1:10,—быка 1 : 50).

У наших животных эта реакция была получена с сыворотками лошади й телки при разведении не выше 1:100, с сывороткой барана № 1 при разведении не выше 1 : 50, а у барана № 2 — 1 :100 (см. таб. 2).

После введения вирусных дрожжей у всех животных можно было отмстить сильно выраженную температурную реакцию (на след. день t° 41, причем высокая температура в пределах от 40° до 41° держалась в течение 2-х дней, а затем пала до нормы. Такую же реакцию можно было наблюдать и у барана № 2, которому была введена к-ра одних дрожжей.

На 14-й день и 30-й день после третьей инъекции сыворотки всех животных испытывались на присутствие агглютининов к Proteus Х₁₉ Результаты этих опытов (см. табл. № 2) указывают на значительное повышение титра агглютинации. Так, сыворотка дала слабо-положительную р. (+) при разведении 1:800 на 14 день, и положительную р. (++) при разведении 1:1200 на 30-й день; сыворотка телки положительную реакцию при разведении 1:400 на 14 день и слабо положительную при разведении 1: 1200 на 30 день, а сыворотка барана № 1 на 14 день дала положительную реакцию при разведении ее 1:400 и в той же степени реакцию при разведении 1 : 1200 на 30 день; в разведениях меньших все эти сыворотки дали резко положительную реакцию ( +++).

Титр сыворотки контрольного барана № 2, иммунизированного одними дрожжами, оказался неизмененным и не превышая 1:10.

Таким образом повышение титра сыворотки животных, обработанных вирусными дрожжами, мы должны объяснить влиянием вируса, находящегося в дрожжевых культурах. Через месяц после Зй инъекции к-р телка и баран № 1 были обескровлены, а у лошади были произведены 3 кровопускания с промежутком в один день. У барана № 2 (контрольн.) кровь была взята также через месяц.

В дальнейшем полученные сыворотки инактивированные и не нагретые, все с прибавлением 0,5% хлороформа были испытаны в отношении вирулицидных свойств и лечебных на морских свинках.

Опыты изучения вирулицидных свойств ставились следующим образом: 5 к.с. сыворотки смешивались с 1 к.с. вирусного мозга (1 :20) м. св., зараженной пассажным вирусом, полученный нами в 1933 г. заражением м. св. кровью больного сыпным тифом и проделавшим к моменту этих опытов 13 пассажей. Для характеристики пассажного вируса необходимо отметить, что при внутрибрюшинном введении 1/20 мозга, взятого на 3—4 день лихорадки, превышение t° обычно появлялось на 4—7 день и лихорадка продолжалась в течение 10 — 12 дней.

Смесь сыворотки и вируса выдерживалась 2 часа при t° 36° и тотчас же вводилась в брюшную полость м. св. В качество контрольных опытов вводилась смесь: во 1) 1 к.с. вир. мозга (1 :20) 4-5 к.с. физиолог. раствора NaCl, сохранявшееся с хлороформом в количество 0,5%, и во 2) смеси 1 к. с. вир. мозга (1 :20) + нормальная сыворотка лошади, барана, толки. Все эти смеси также выдерживались 2 часа при 36°.

В ряде случаев, когда введение смеси вируса и сыворотки не вызывало появления лихорадки, через 2 месяца со времени введения смеси, производилось повторное заражение 1/20 вирусного мозга интраперитонеально, для исключения рефрактэрности этих м. свинок к сыпнотифозной инфекции. Результаты всех этих опытов приведены в нижеслед. таблице: Таблица № 3.

Все иммунные сыворотки, испытанные на 42 день их хранения, предотвратили развитие лихорадки (температ. кривые см. ниже) и при повторном заражении м. свинок одним вирусом появлялась типичная лихорадка на 4 —8 день. При испытании нормальных сывороток и сыворотки барана (№ 2), проиммунизированного культурой одних дрожжей без вируса, наступало, как правило, развитие типичной лихорадки на 5—9 день, при этом необходимо отметить, что в большом ряде случаев применялись сыворотки более свежие (11—19 дней с момента получения) нежели сыворотки иммунные и только в 4-х случаях сыворотки, хранившиеся 40 дней. В 4 - х случаях развития лихорадки не наступало и в 1 случае наблюдалось повышение t° в виде однодневного приступа на 11 день. Все эти 5 случаев касаются исключительно опытов с ненагретыми нормальными сыворотками. При повторном заражении 2 м. св. из этой группы наблюдалась лихорадка укороченная (в теч. 6 дней), что дает возможность сделать предположение о неполном исчезновении вируса в смеси и в таком случае возможно допустить—при заражении смесью ненагретой нормальной сыворотки с вирусом, развитие скрытой инфекции. При действии же иммунной сыворотки на вирус во всех случаях, как было отмечено выше, повторное заражение вызывало появление длительной лихорадки.

Ввиду того, что в опытах с нормальными сыворотками, а именно с ненагретыми сыворотками, отмечаюгся вирулицидные свойства последних, мы должны в опытах с иммунными сыворотками учитывать только те результаты, которые были получены с иагретыми сыворотками. Контрольные опыты с инактивированными нормальными сыворотками (8 случаев) и с инактивированными сыворотками барана (№ 2), иммунизированною чистой к-рой дрожжей (без вируса), в 8 случаях дали типичную лихорадку и в одном только случае—укороченную (оп. с нормальной инактивирован. лошад. сывор. № 3). Температурные кривые м. свин., зараженных смесью вируса с инактивированной иммунной сывороткой,—см. стр. № 92.

Таким образом, на основании результатов опытов испытания вирулицидных свойств сывороток, полученных от лошади, барана и телки, про- иммунизированных вирусными дрожжами, мы можем сделать вывод, что эти сыворотки действительно обладают вирулицидными свойствами в отличие от сывороток нормальных. Применяя, хотя и ослабленный, благодаря выращиванию в к-ре дрожжей сыпно-тифозный вирус, возможно получение иммунных сывороток. Однако, сила этих сывороток оказывается еще незначительной, так как при постановке опытов с иммунными сыворотками (в объеме 5 кс.), сохранившимися в течение 60 дней, вирулицидные свойства уже не могли быть установлены. Одновременно с опытами по определению вирулицидных свойств, эти же сыворотки были применены на м. св., с целью изучения влияния их на течение инфекции. Но ввиду того, что в этом отношении сыворотки оказались малодеятельными, мы отказались от дальнейшего их применения. Всего было поставлено 8 опытов с сыворотками лошади, телки и барана. Морским свинкам, зараженным интраперитонеально 1/20 вир. мозга, в тот же день вводилось подкожно 5 к. с. иммунной сыворотки (сообщение В. Елина и Э. Френкмана об успешных опытах лечения сыпного тифа м. св. сывороткой реконвалесцентов при условии 3-кратного введения сыворотки еще не было опубликовано). Какого-либо резкого влияния на течение инфекции сыворотки не оказали. Можно было отметить только некоторое удлинение инкубационного периода, снижение лихорадки и укорочение ее в некоторых случаях до 6 дней по сравнению с контрольными м. св., не обработанными и теми, которым была введена в том же количестве нормальная сыворотка.

Рис. 1-3

Нам кажется, что применяя вирус менее измененный, т. е. пользуясь к-рами ранних генераций, возможно будет получить и более действенные сыворотки.

Опыты вакцинации культуральным вирусом.

Для опытов изучения вакцинирующих свойств убитых вирусных дрожжей, (к ра II шт, 22 генер. с Saccharomyces сеrеѵ., раса М) применялись к-ры, убитые во 1) нагреванием при 50° в теч. 40 мин., 2) действием 0,2% формалина в теч. 2 суток при 36°, 3) добавлением 0,5% ас. carbol, и в 4) прибавлением 0,5% хлороформа. Все вакцины применялись концентрированными в 10 раз. Вакцинации подверглись 8 м. св. и 4 кролика (по 2 м. св. и 1 кролику каждой вакциной).

Инъекции производились подкожно с промежутком в 5 дней—м. св. в дозе: 0.2, 0,4 и 0,6 к.с, а кроликам по 0,4, 0,8 и 1,2 к.с. У кроликов до вакцинации исследовалась кровь на р. Wеі1 - Felіх’а. У м. св. после 2 и 3 инъекции наблюдалось однодневное повышение t° от 0,5 до 1,0° и в месте впрыскивания вакцины — небольшие, довольно плотные инфильтраты.

При исследовании крови кроликов на р. W.-F. в периоде вакцинации появление агглютининов к b. proteus отмечалось у кроликов, обрабонанных нагретой, формалинизированной и карболизированной вакциной.

Через 1 месяц тонеально после 3-й инъекции м.св. были заражены интраперитонеально 1/15, а три кролика подкожно 1/5 вирусного мозга (кролик вакциниров. хлороформ. вакциной погиб от случайной инфекции до заражения вирусом), одновременно для контроля были заражены соответствующими дозами 2 нормальных м. св. и один кролик. О развитии инфекции у кроликов мы судим по р Weil-Felix’a. Что касается м.св,, то все они дали типичную лихорадку, а появление агглютининов к b. proteus X₁₉ было отмечено лишь у кролика, иммунизированною нагретой вакциной и у контрольною, у кроликов же, вакцинированныя формалинизированными и карболизированными вирусными дрожжами, титр р. Weil- FeІіх’а не только повысился, а наоборот, положительная реакция W.-F., наблюдавшаяся после вакцинации, перешла в отрицательную с OХ₁₉ и в слабоположительную с ОХ₁₉. Для иллюстрации изменений р. W.-F. у кроликов мы приводим таблицу.

О. р. не ставилась.

Казалось бы, что судя по этим данным можно было бы сказать, что у кроликов 338 и 242, обработанных формалиновой и карболизированной вакцинами заражение вирусом не вызвало появления инфекции, но ввиду малого количества опытов, мы воздерживаемся от окончательных выводов.

На основании всех приведенных нами опытов по выращиванию сыпнотифозною вируса в дрожжевых культурах и опытов иммунизации культуральным вирусом животных, мы позволяем себе сделать следующие выводы:

1) Для выращивания сыпно-тифозного вируса из крови людей, больных сыпным тифом, возможно применение наряду с кефирными дрожжами и дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

2) Метод выращивания вируса в дрожжевых к-рах дает возможность сохранения вируса в ограниченном числе генераций, причем даже и в начальных генерациях такой вирус не вызывает у м. свинок вполне типичной лихорадки.

3) При иммунизации животных (лошадь, теленок, баран) культуральным вирусом возможно получение иммунных сывороток, обладающих ясно выраженными вирулицидными свойствами.

²) См. Казанск. мед. жур. 1934 г., № 11—12.