The characteristics of serum circulating immune complexes of patients with atopic asthma with different severity degree

Full Text

Концепция патогенеза бронхиальной астмы клеточные элементы в зависимости от вида представляет его как воспалительный процесс, антигена, с обязательным участием антител. Одведущий к развитию бронхиальной обструкции ной из важнейших функций иммуноглобулинов и повышенной гиперреактивности бронхов в является связывание антигена и образование ответ на различные стимулы [3, 5]. Иммунный иммунных комплексов. Образование последних ответ проявляется развитием клеточных и гу-должно завершаться нейтрализацией или элиморальных реакций, включающих различные минацией антигена, но при некоторых условиях иммунные комплексы могут фиксироваться в соАдрес для переписки: yuliya_ksu@mail.ru судах, инициируя воспаление. Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) представляют собой гетерогенную по размерам и составу антител и антигенов популяцию. При избытке тех или других генерируются мелкие комплексы, при их эквимолярных соотношениях формируются крупные комплексы с преобладанием антител [9]. ЦИК способны стимулировать развитие иммунного ответа организма. В норме эти комплексы быстро элиминируются из крови, но при длительном воздействии антигенов уровень ЦИК в крови повышается [7, 9]. Также повышение происходит и при заболеваниях, характеризующихся развитием аутоиммунных процессов [6, 11]. Один из существенных факторов, имеющих значение для проявления патогенности ЦИК, - их размер [8]. Наибольший патологический потенциал присущ растворимым иммунным комплексам средних размеров, сформированным при небольшом избытке антигена, способном активировать комплемент. Дисфункция иммунной системы при бронхиальной астме может приводить к развитию аутоиммунных процессов, и в последнее время обсуждают возможную взаимосвязь между этими двумя состояниями [1, 5]. Всё больше сторонников находит концепция аутореактивности как одного из патогенетических механизмов развития атопических заболеваний. Существует ряд работ, подтверждающих участие аутоиммунных процессов в патогенезе бронхиальной астмы [10, 12]. Цель представленной работы - оценка содержания ЦИК в сыворотке больных лёгкой и тяжёлой формами атопической бронхиальной астмы. В работе были использованы образцы сывороток больных атопической бронхиальной астмой (n=50) в возрасте от 19 до 45 лет, госпитализированных в пульмонологическое отделение Республиканской клинической больницы г. Казани. У 30 пациентов установлен диагноз атопической бронхиальной астмы лёгкого персистирующего течения, у 20 пациентов - атопической бронхиальной астмы тяжёлого персистирующего течения. Диагноз и степень тяжести верифицировали согласно критериям «Глобальной стратегии диагностики, профилактики и лечения астмы» (GINA, 2008). Группу контроля составили 15 практически здоровых добровольцев в возрасте от 20 до 34 лет (средний возраст 27±7 года), которые не имели отягощённого аллергологического анамнеза, с отрицательными результатами кожных аллергических проб, уровнем иммуноглобулина Е менее 100 МЕ/мл, нормальными показателями функции внешнего дыхания. Всем больным проводили общее клиническое обследование, включавшее общий анализ крови с подсчётом лейкоцитарной формулы, общий анализ мокроты, рентгенографию органов грудной клетки, электрокардиографию, исследование функции внешнего дыхания методом спирометрии (аппарат «АД О3-М», Казань) с определением объёмных и скоростных параметров. Программа аллергологического обследования включала анализ аллергологического анамнеза, кожное тестирование с набором стандартных диагностических аллергенов (ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова Москва, ГП «Аллерген», Ставрополь), определение уровня общего и специфического иммуноглобулина Е в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа. Выделение ЦИК. Образцы крови центрифугировали в течение 10 мин при 10 000 оборотах в минуту («Eppendorf», 5415R). На последующих этапах использовали сыворотку. Выделение гигантских, крупных, средних и мелких ЦИК проводили осаждением 125 мкл сыворотки крови, разбавленной в 0,2 М боратном буфере, водородный показатель (рН) 8,6, - соответственно в 3, 3,5, 4 и 7% полиэтиленгликоле (6 кДа) в конечном объёме инкубационной смеси. После инкубации при 4 ○С в течение 18-20 ч смесь центрифугировали в течение 10 мин при 3000 оборотах в минуту («Eppendorf», 5415R). Полученные осадки содержали разные по размеру фракции ЦИК, условно названные гигантскими (3%), крупными (3,5%) и средними (4%). К надосадочному раствору 3,5% полиэтиленгликоля добавляли 22% раствор полиэтиленгликоля в том же буфере до конечной концентрации 7%, инкубировали при 4 ○С в течение 18-20 ч, а осадок, содержащий мелкие ЦИК, отделяли центрифугированием. Для оценки количественного содержания ЦИК в сыворотке крови полученные осадки суспендировали в 0,1 М растворе NaОН и измеряли плотность оптического поглощения в ультрафиолетовой области спектра при 280 нм. Концентрацию ЦИК выражали в единицах оптической плотности при 280 нм. Освобождение ЦИК от иммуноглобулинов. Сефарозу перед употреблением уравновешивали 0,5 мМ раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,5-7,5. Освобождение ЦИК от иммуноглобулинов и других белков, не входящих в состав комплексов, осуществляли преципитацией ЦИК с помощью протеин G-сефарозы («Amersham-Pharmacia-Biotech», Швеция). К осадкам ЦИК добавляли 50 мкл 0,2 М боратного буфера, рН 8,6, суспендировали, далее добавляли 10 мкл максимально насыщенной суспензии сефарозы и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. После инкубации смесь центрифугировали в течение 10 мин при 3000 оборотах в минуту («Eppendorf», 5415R), осадок промывали 3 раза тем же буфером, после чего элюировали чистую фракцию ЦИК 50 мкл 0,2 М глицина в 0,002 М растворе НСl, рН 2,2, центрифугировали в течение 10 мин при 3000 оборотах в минуту и брали надосадок с антигенами для последующего изучения белкового состава. Определение белкового состава ЦИК. Белковый состав ЦИК определяли методом электрофореза. Его проводили в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Гель, содержащий 8% акриламид, готовили с использованием 30% раствора акриламида и 0,8% раствора метиленбисакриламида. Буфер 8% геля содержал 0,375 М трис-НСl, 0,4% додецилсульфата натрия (рН 8,8). Электрофорез проводили в вертикальном направлении при силе тока 30 мА в электродном буфере следующего состава: 0,025М трис, 0,192 М глицин, 0,1% раствор додецилсульфата натрия (рН 8,3). По окончании электрофореза гель фиксировали в 20% растворе этанола на 7% уксусной кислоте. После фиксации гель промывали и проводили окрашивание серебром. Математический анализ полученных результатов проводили с использованием пакета программ Excel (Microsoft office 2007). Были использованы структурные характеристики (медиана, перцентили), а для оценки различий между отдельными выборками применяли непараметрические критерии Краскела-Уоллиса (для общей характеристик выборки) и T-критерия Манна-Уитни (для парных сравнений различных выборок). Корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции Спирмена (rs). Статистически значимыми считали различия при значениях двустороннего p <0,05. Проблема формирования и характер последующего течения бронхиальной астмы в патогенетическом плане в значительной степени связана с иммунологическими нарушениями. Вместе с тем диагностическая значимость отдельных показателей иммунной системы остаётся недостаточно изученной, в частности при атопической форме бронхиальной астмы, и это в первую очередь касается ЦИК и их составляющих. Образование ЦИК - физиологический процесс, и в зависимости от состава они усиливают или угнетают иммунный ответ. Известно, что размер ЦИК становится существенным фактором, имеющим значение для проявления их патогенных свойств [8, 9]. Низкомолекулярные комплексы хуже по сравнению с крупными комплексами активируют комплемент. Результат этого - их длительное присутствие в циркуляции и, как следствие, повышение вероятности отложения агрегатов в различных тканях [1, 8]. Таким образом, определяя размер ЦИК, можно косвенно оценивать их биологические свойства и возможные негативные последствия. По этой причине на первом этапе исследований была проведена оценка содержания ЦИК в зависимости от их размера. Результаты показали, что у больных как лёгкой, так и тяжёлой формой заболевания наблюдается достоверное по сравнению с контролем повышение уровня мелких и средних ЦИК (рис. 1). Большое диагностическое значение имеет коэффициент аутоиммунизации (КА), предложенный Рудык и Барановским [1], который определяют по формуле: При КА, равном 1,5-4,0, считают доказанным участие иммунопатологических реакций в развитии заболевания. Рис. 1. Концентрация циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) гигантских, крупных, средних и мелких размеров в сыворотке крови здоровых доноров и больных лёгкой и тяжёлой формой атопической бронхиальной астмы (АБА). *р <0,05 по сравнению с нормой. Используя данную формулу, мы определили КА у больных с лёгкой и тяжёлой формами астмы. При этом значение КА возрастало линейно с уменьшением размера ЦИК. При лёгком течении атопической бронхиальной астмы коэффициент КА гигантских ЦИК составил 0,96, КА крупных ЦИК - 1,6, КА средних ЦИК - 1,51, КА мелких ЦИК - 1,86. При тяжёлом течении атопической бронхиальной астмы коэффициент КА гигантских ЦИК составил 1,06, КА крупных ЦИК - 2, КА средних ЦИК - 2,03, КА мелких ЦИК - 2,30. Таким образом, вычисленные коэффициенты КА у больных лёгкой и тяжёлой формами указывают на участие крупных, средних и мелких ЦИК в иммунопатологических реакциях. Для определения содержания патогенных субфракций ЦИК был использован метод П.В. Стручкова [2], основанный на определении коэффициента размера ЦИК по формуле: К=К2/К1, где К1 и К2 - концентрации гигантских и средних ЦИК соответственно (рис. 2). Результаты показали, что коэффициент патогенности достоверно повышается у больных бронхиальной астмой по отношению к контрольной группе. Согласно данным литературы, при многих заболеваниях, характеризующихся нарушениями иммунного статуса, белковый (антигенный) состав ЦИК различен [2, 4]. Это приводит к необходимости идентификации соответствующих белковых компонентов. На рис. 3 показана электрофореграмма гигантских, крупных, средних и мелких ЦИК больных лёгкой формой бронхиальной астмы до (а) и после (б) очистки. Для данной группы больных характерно наличие белков одной молекулярной массы (60 кДа) в комплексах всех размеров. Наибольшее количество обнаружено в крупных комплексах (3,5%). В сыворотке крови больных тяжёлой формой атопической бронхиальной астмой обнаружены белки с молекулярной массой 60 кДа в крупных ЦИК (3,5%) и небольшое количество в мелких (7%). Также выявлена индивидуальная группа белков с молекулярной массой 36 кДа в составе мелких ЦИК (см. рис. 3г). Таким образом, электрофоретический анализ ЦИК больных бронхиальной астмой показал наличие белков с молекулярной массой 60 кДа в комплексах всех размеров. В группе пациентов с тяжёлой формой бронхиальной астмы в составе мелкомолекулярных ЦИК установлено наличие фракции антигена с молекулярной массой 36 кДа. ВЫВОДЫ Проведённые исследования показали, что у больных атопической бронхиальной астмой происходит повышение концентрации циркулирующих иммунных комплексов по сравнению с относительно здоровыми людьми. Отмечено преобладание мелко- и среднедисперсных циркулирующих иммунных комплексов, степень уменьшения дисперсности коррелировала с тяжестью бронхиальной астмы. Рис. 3. Электрофореграммы белкового состава циркулирующих иммунных комплексов сывороток больных атопической бронхиальной астмой: а - белковый состав сыворотки крови больных лёгкой формой до очистки; б - белковый состав сыворотки больных лёгкой формой после очистки; в - белковый состав сыворотки больных тяжёлой формой до очистки; г - белковый состав сыворотки больных тяжёлой формой после очистки. Показано наличие индивидуальной фракции белков с молекулярной массой 36 кДа в группе с тяжёлой формой заболевания. 3. Выявленное повышение уровня цирку-the blood of patients with hemorrhagic strokes // Westnik лирующих иммунных комплексов мелких и IAELPS. - 2001. - Vol. 6, N 42. - P. 97-99. 5. Buc M., Dzurilla M., Bucova M. Immunophathogenesis средних размеров в сыворотке крови больных of bronchial asthma //Arch. Immunol. Ther. Exp. - 2009. - атопической бронхиальной астмой может быть Vol. 57. - P. 331-344. показателем предрасположенности этой катего 6. Cengic M., Rasic S. Importance of determination of рии пациентов к развитию иммунопатологиче circulating immune complexes in systemic lupus erythemato ских реакций, что согласуется с литературными sus // Med. Arch. - 2002. - Vol. 56. - P. 267-270. данными об ассоциации бронхиальной астмы с 7. Mackay I.R., Water J.V., Gershwin M.E. Autoimmunity: рядом аутоиммунных заболеваний. thoughts for the millennium // Clin. Rev. Allergy Immu nol. - 2000. - Vol. 18, N 1. - P. 87-117. ЛИТЕРАТУРА 8. Nangaku M., Couser W.G. Mechanisms of immune-de posit formation and the mediation of immune renal injury // Clin. Exper. Nephrol. - 2005. - Vol. 9. - P. 183-191. 1. Рудык Б.И., Барановский П.В. Сравнительная 9. Nezlin R.A. Quantitative approach to the determinaоценка изучения содержания иммунных комплекtion of antigen in immune complexes // J. Immunol. Meсов при инфаркте миокарда, бронхиальной астме и thods. - 2000. - Vol. 237. - P. 1-16. ревматоидном артрите // Тер. арх. - 1984. - №10. - 10. Rottem M., Shoenfeld Y. Asthma as a paradigmС. 17-19. for autoimmune disease // Int. Arch. Allergy Immunol. - 2. Стручков П.В., Константинова Н.А., Лаврен 2003. - Vol. 132, N 3. - P. 210-214. тьев В.В., Чучалин А.Г. Скрининг-тест для оценки 11. Voskuyl A.E., Hazes J.M., Zwinderman A.H. et al. Diag патогенных свойств циркулирующих иммунных комnostic strategy for the assessment of rheumatoid vasculitis // плексов // Лаб. дело. - 1985. - Т. 7. - С. 410-412. Ann. Rheum. Dis. - 2003. - Vol. 62, N 5. - P. 407-413. 3. Чучалин А.Г. Глобальная стратегия лечения и 12. Ye Y.M., Nahm D.H., Kim S.H. et al. Circulating au профилактики бронхиальной астмы. - М.: Атмосфеtoantibodies in patients with aspirin-intolerant asthma: an ра, 2008. - 108 с. epiphenomenon related to airway inflammation // J. Korean 4. Bakunts G., Arakelyan A., Boyajyan A., Poghosyan A. Med. Sci. - 2006. - Vol. 21. - P. 412-417. Antigen composition of circulating immune complexes in

About the authors

Y V Skibo

Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan, Russia

Email: yuliya_ksu@mail.ru

N S Kurmaeva

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

V N Tsibulkina

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

I G Mustafin

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

Z I Abramova

Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan, Russia

References

Supplementary files