Характеристика циркулирующих иммунных комплексов сыворотки больных атопической бронхиальной астмой разной степени тяжести

Полный текст

Концепция патогенеза бронхиальной астмы клеточные элементы в зависимости от вида представляет его как воспалительный процесс, антигена, с обязательным участием антител. Одведущий к развитию бронхиальной обструкции ной из важнейших функций иммуноглобулинов и повышенной гиперреактивности бронхов в является связывание антигена и образование ответ на различные стимулы [3, 5]. Иммунный иммунных комплексов. Образование последних ответ проявляется развитием клеточных и гу-должно завершаться нейтрализацией или элиморальных реакций, включающих различные минацией антигена, но при некоторых условиях иммунные комплексы могут фиксироваться в соАдрес для переписки: yuliya_ksu@mail.ru судах, инициируя воспаление. Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) представляют собой гетерогенную по размерам и составу антител и антигенов популяцию. При избытке тех или других генерируются мелкие комплексы, при их эквимолярных соотношениях формируются крупные комплексы с преобладанием антител [9]. ЦИК способны стимулировать развитие иммунного ответа организма. В норме эти комплексы быстро элиминируются из крови, но при длительном воздействии антигенов уровень ЦИК в крови повышается [7, 9]. Также повышение происходит и при заболеваниях, характеризующихся развитием аутоиммунных процессов [6, 11]. Один из существенных факторов, имеющих значение для проявления патогенности ЦИК, - их размер [8]. Наибольший патологический потенциал присущ растворимым иммунным комплексам средних размеров, сформированным при небольшом избытке антигена, способном активировать комплемент. Дисфункция иммунной системы при бронхиальной астме может приводить к развитию аутоиммунных процессов, и в последнее время обсуждают возможную взаимосвязь между этими двумя состояниями [1, 5]. Всё больше сторонников находит концепция аутореактивности как одного из патогенетических механизмов развития атопических заболеваний. Существует ряд работ, подтверждающих участие аутоиммунных процессов в патогенезе бронхиальной астмы [10, 12]. Цель представленной работы - оценка содержания ЦИК в сыворотке больных лёгкой и тяжёлой формами атопической бронхиальной астмы. В работе были использованы образцы сывороток больных атопической бронхиальной астмой (n=50) в возрасте от 19 до 45 лет, госпитализированных в пульмонологическое отделение Республиканской клинической больницы г. Казани. У 30 пациентов установлен диагноз атопической бронхиальной астмы лёгкого персистирующего течения, у 20 пациентов - атопической бронхиальной астмы тяжёлого персистирующего течения. Диагноз и степень тяжести верифицировали согласно критериям «Глобальной стратегии диагностики, профилактики и лечения астмы» (GINA, 2008). Группу контроля составили 15 практически здоровых добровольцев в возрасте от 20 до 34 лет (средний возраст 27±7 года), которые не имели отягощённого аллергологического анамнеза, с отрицательными результатами кожных аллергических проб, уровнем иммуноглобулина Е менее 100 МЕ/мл, нормальными показателями функции внешнего дыхания. Всем больным проводили общее клиническое обследование, включавшее общий анализ крови с подсчётом лейкоцитарной формулы, общий анализ мокроты, рентгенографию органов грудной клетки, электрокардиографию, исследование функции внешнего дыхания методом спирометрии (аппарат «АД О3-М», Казань) с определением объёмных и скоростных параметров. Программа аллергологического обследования включала анализ аллергологического анамнеза, кожное тестирование с набором стандартных диагностических аллергенов (ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова Москва, ГП «Аллерген», Ставрополь), определение уровня общего и специфического иммуноглобулина Е в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа. Выделение ЦИК. Образцы крови центрифугировали в течение 10 мин при 10 000 оборотах в минуту («Eppendorf», 5415R). На последующих этапах использовали сыворотку. Выделение гигантских, крупных, средних и мелких ЦИК проводили осаждением 125 мкл сыворотки крови, разбавленной в 0,2 М боратном буфере, водородный показатель (рН) 8,6, - соответственно в 3, 3,5, 4 и 7% полиэтиленгликоле (6 кДа) в конечном объёме инкубационной смеси. После инкубации при 4 ○С в течение 18-20 ч смесь центрифугировали в течение 10 мин при 3000 оборотах в минуту («Eppendorf», 5415R). Полученные осадки содержали разные по размеру фракции ЦИК, условно названные гигантскими (3%), крупными (3,5%) и средними (4%). К надосадочному раствору 3,5% полиэтиленгликоля добавляли 22% раствор полиэтиленгликоля в том же буфере до конечной концентрации 7%, инкубировали при 4 ○С в течение 18-20 ч, а осадок, содержащий мелкие ЦИК, отделяли центрифугированием. Для оценки количественного содержания ЦИК в сыворотке крови полученные осадки суспендировали в 0,1 М растворе NaОН и измеряли плотность оптического поглощения в ультрафиолетовой области спектра при 280 нм. Концентрацию ЦИК выражали в единицах оптической плотности при 280 нм. Освобождение ЦИК от иммуноглобулинов. Сефарозу перед употреблением уравновешивали 0,5 мМ раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,5-7,5. Освобождение ЦИК от иммуноглобулинов и других белков, не входящих в состав комплексов, осуществляли преципитацией ЦИК с помощью протеин G-сефарозы («Amersham-Pharmacia-Biotech», Швеция). К осадкам ЦИК добавляли 50 мкл 0,2 М боратного буфера, рН 8,6, суспендировали, далее добавляли 10 мкл максимально насыщенной суспензии сефарозы и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. После инкубации смесь центрифугировали в течение 10 мин при 3000 оборотах в минуту («Eppendorf», 5415R), осадок промывали 3 раза тем же буфером, после чего элюировали чистую фракцию ЦИК 50 мкл 0,2 М глицина в 0,002 М растворе НСl, рН 2,2, центрифугировали в течение 10 мин при 3000 оборотах в минуту и брали надосадок с антигенами для последующего изучения белкового состава. Определение белкового состава ЦИК. Белковый состав ЦИК определяли методом электрофореза. Его проводили в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Гель, содержащий 8% акриламид, готовили с использованием 30% раствора акриламида и 0,8% раствора метиленбисакриламида. Буфер 8% геля содержал 0,375 М трис-НСl, 0,4% додецилсульфата натрия (рН 8,8). Электрофорез проводили в вертикальном направлении при силе тока 30 мА в электродном буфере следующего состава: 0,025М трис, 0,192 М глицин, 0,1% раствор додецилсульфата натрия (рН 8,3). По окончании электрофореза гель фиксировали в 20% растворе этанола на 7% уксусной кислоте. После фиксации гель промывали и проводили окрашивание серебром. Математический анализ полученных результатов проводили с использованием пакета программ Excel (Microsoft office 2007). Были использованы структурные характеристики (медиана, перцентили), а для оценки различий между отдельными выборками применяли непараметрические критерии Краскела-Уоллиса (для общей характеристик выборки) и T-критерия Манна-Уитни (для парных сравнений различных выборок). Корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции Спирмена (rs). Статистически значимыми считали различия при значениях двустороннего p <0,05. Проблема формирования и характер последующего течения бронхиальной астмы в патогенетическом плане в значительной степени связана с иммунологическими нарушениями. Вместе с тем диагностическая значимость отдельных показателей иммунной системы остаётся недостаточно изученной, в частности при атопической форме бронхиальной астмы, и это в первую очередь касается ЦИК и их составляющих. Образование ЦИК - физиологический процесс, и в зависимости от состава они усиливают или угнетают иммунный ответ. Известно, что размер ЦИК становится существенным фактором, имеющим значение для проявления их патогенных свойств [8, 9]. Низкомолекулярные комплексы хуже по сравнению с крупными комплексами активируют комплемент. Результат этого - их длительное присутствие в циркуляции и, как следствие, повышение вероятности отложения агрегатов в различных тканях [1, 8]. Таким образом, определяя размер ЦИК, можно косвенно оценивать их биологические свойства и возможные негативные последствия. По этой причине на первом этапе исследований была проведена оценка содержания ЦИК в зависимости от их размера. Результаты показали, что у больных как лёгкой, так и тяжёлой формой заболевания наблюдается достоверное по сравнению с контролем повышение уровня мелких и средних ЦИК (рис. 1). Большое диагностическое значение имеет коэффициент аутоиммунизации (КА), предложенный Рудык и Барановским [1], который определяют по формуле: При КА, равном 1,5-4,0, считают доказанным участие иммунопатологических реакций в развитии заболевания. Рис. 1. Концентрация циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) гигантских, крупных, средних и мелких размеров в сыворотке крови здоровых доноров и больных лёгкой и тяжёлой формой атопической бронхиальной астмы (АБА). *р <0,05 по сравнению с нормой. Используя данную формулу, мы определили КА у больных с лёгкой и тяжёлой формами астмы. При этом значение КА возрастало линейно с уменьшением размера ЦИК. При лёгком течении атопической бронхиальной астмы коэффициент КА гигантских ЦИК составил 0,96, КА крупных ЦИК - 1,6, КА средних ЦИК - 1,51, КА мелких ЦИК - 1,86. При тяжёлом течении атопической бронхиальной астмы коэффициент КА гигантских ЦИК составил 1,06, КА крупных ЦИК - 2, КА средних ЦИК - 2,03, КА мелких ЦИК - 2,30. Таким образом, вычисленные коэффициенты КА у больных лёгкой и тяжёлой формами указывают на участие крупных, средних и мелких ЦИК в иммунопатологических реакциях. Для определения содержания патогенных субфракций ЦИК был использован метод П.В. Стручкова [2], основанный на определении коэффициента размера ЦИК по формуле: К=К2/К1, где К1 и К2 - концентрации гигантских и средних ЦИК соответственно (рис. 2). Результаты показали, что коэффициент патогенности достоверно повышается у больных бронхиальной астмой по отношению к контрольной группе. Согласно данным литературы, при многих заболеваниях, характеризующихся нарушениями иммунного статуса, белковый (антигенный) состав ЦИК различен [2, 4]. Это приводит к необходимости идентификации соответствующих белковых компонентов. На рис. 3 показана электрофореграмма гигантских, крупных, средних и мелких ЦИК больных лёгкой формой бронхиальной астмы до (а) и после (б) очистки. Для данной группы больных характерно наличие белков одной молекулярной массы (60 кДа) в комплексах всех размеров. Наибольшее количество обнаружено в крупных комплексах (3,5%). В сыворотке крови больных тяжёлой формой атопической бронхиальной астмой обнаружены белки с молекулярной массой 60 кДа в крупных ЦИК (3,5%) и небольшое количество в мелких (7%). Также выявлена индивидуальная группа белков с молекулярной массой 36 кДа в составе мелких ЦИК (см. рис. 3г). Таким образом, электрофоретический анализ ЦИК больных бронхиальной астмой показал наличие белков с молекулярной массой 60 кДа в комплексах всех размеров. В группе пациентов с тяжёлой формой бронхиальной астмы в составе мелкомолекулярных ЦИК установлено наличие фракции антигена с молекулярной массой 36 кДа. ВЫВОДЫ Проведённые исследования показали, что у больных атопической бронхиальной астмой происходит повышение концентрации циркулирующих иммунных комплексов по сравнению с относительно здоровыми людьми. Отмечено преобладание мелко- и среднедисперсных циркулирующих иммунных комплексов, степень уменьшения дисперсности коррелировала с тяжестью бронхиальной астмы. Рис. 3. Электрофореграммы белкового состава циркулирующих иммунных комплексов сывороток больных атопической бронхиальной астмой: а - белковый состав сыворотки крови больных лёгкой формой до очистки; б - белковый состав сыворотки больных лёгкой формой после очистки; в - белковый состав сыворотки больных тяжёлой формой до очистки; г - белковый состав сыворотки больных тяжёлой формой после очистки. Показано наличие индивидуальной фракции белков с молекулярной массой 36 кДа в группе с тяжёлой формой заболевания. 3. Выявленное повышение уровня цирку-the blood of patients with hemorrhagic strokes // Westnik лирующих иммунных комплексов мелких и IAELPS. - 2001. - Vol. 6, N 42. - P. 97-99. 5. Buc M., Dzurilla M., Bucova M. Immunophathogenesis средних размеров в сыворотке крови больных of bronchial asthma //Arch. Immunol. Ther. Exp. - 2009. - атопической бронхиальной астмой может быть Vol. 57. - P. 331-344. показателем предрасположенности этой катего 6. Cengic M., Rasic S. Importance of determination of рии пациентов к развитию иммунопатологиче circulating immune complexes in systemic lupus erythemato ских реакций, что согласуется с литературными sus // Med. Arch. - 2002. - Vol. 56. - P. 267-270. данными об ассоциации бронхиальной астмы с 7. Mackay I.R., Water J.V., Gershwin M.E. Autoimmunity: рядом аутоиммунных заболеваний. thoughts for the millennium // Clin. Rev. Allergy Immu nol. - 2000. - Vol. 18, N 1. - P. 87-117. ЛИТЕРАТУРА 8. Nangaku M., Couser W.G. Mechanisms of immune-de posit formation and the mediation of immune renal injury // Clin. Exper. Nephrol. - 2005. - Vol. 9. - P. 183-191. 1. Рудык Б.И., Барановский П.В. Сравнительная 9. Nezlin R.A. Quantitative approach to the determinaоценка изучения содержания иммунных комплекtion of antigen in immune complexes // J. Immunol. Meсов при инфаркте миокарда, бронхиальной астме и thods. - 2000. - Vol. 237. - P. 1-16. ревматоидном артрите // Тер. арх. - 1984. - №10. - 10. Rottem M., Shoenfeld Y. Asthma as a paradigmС. 17-19. for autoimmune disease // Int. Arch. Allergy Immunol. - 2. Стручков П.В., Константинова Н.А., Лаврен 2003. - Vol. 132, N 3. - P. 210-214. тьев В.В., Чучалин А.Г. Скрининг-тест для оценки 11. Voskuyl A.E., Hazes J.M., Zwinderman A.H. et al. Diag патогенных свойств циркулирующих иммунных комnostic strategy for the assessment of rheumatoid vasculitis // плексов // Лаб. дело. - 1985. - Т. 7. - С. 410-412. Ann. Rheum. Dis. - 2003. - Vol. 62, N 5. - P. 407-413. 3. Чучалин А.Г. Глобальная стратегия лечения и 12. Ye Y.M., Nahm D.H., Kim S.H. et al. Circulating au профилактики бронхиальной астмы. - М.: Атмосфеtoantibodies in patients with aspirin-intolerant asthma: an ра, 2008. - 108 с. epiphenomenon related to airway inflammation // J. Korean 4. Bakunts G., Arakelyan A., Boyajyan A., Poghosyan A. Med. Sci. - 2006. - Vol. 21. - P. 412-417. Antigen composition of circulating immune complexes in

Об авторах

Юлия Валерьевна Скибо

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: yuliya_ksu@mail.ru

Найра Шафкатовна Курмаева

Казанский государственный медицинский университет

Вера Николаевна Цибулькина

Казанский государственный медицинский университет

Ильшат Ганиевич Мустафин

Казанский государственный медицинский университет

Зинаида Ивановна Абрамова

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Список литературы

Дополнительные файлы