Peripheral blood erythrocytes morphology in ovarian cancer

Cover Page

Abstract


Aim. To assess the morphology of circulating red blood cells in patients with stage III ovarian cancer.

Methods. The object of the study was the peripheral blood erythrocytes of primary patients with ovarian cancer (n=25) who had stage III according to International Federation of Gynecology and Obstetrics. Patients were examined in the gynecological department of Ulyanovsk Regional Clinical Oncology Center. The control group included 25 somatically healthy women. Morphological studies were performed using light microscopy. The number of red blood cells with an unchanged and altered shape was expressed as a percentage. By the method of atomic force microscopy, the topology and rigidity of red blood cells was studied.

Results. A statistically significant decrease in the number of circulating blood erythrocytes was found in patients with ovarian cancer compared to somatically healthy women. At the same time, the number of discocytes is markedly reduced while the number of morphologically altered forms: echinocytes, stomatocytes, spherocytes and erythrocyte rigidity are increased.

Conclusion. With the appearance of altered forms of red blood cells and increase of the transformation index and erythrocyte rigidity in patients with stage III ovarian cancer, total number of red blood cells decreases in circulating blood compared to somatically healthy women.


Рак яичников (РЯ) занимает одно из ведущих мест по частоте возникновения и смертности среди злокачественных новообразований у женщин репродуктивного возраста.

Сегодня основное внимание исследователей направлено на тканевую гипоксию, возникающую в солидных опухолях в динамике опухолевого прогрессирования [1–2]. При этом указывают на возможность возникновения под влиянием гипоксии протеомных и геномных нарушений в опухолевых клетках, определяющих гетерогенность опухоли и агрессивное течение опухолевого процесса [3–4].

Основной причиной гипоксии опухоли, как правило, бывают нарушения её сосудистой системы. Снижение кислородотранспортной функции циркулирующих эритроцитов при этом не рассматривают, хотя, помимо негативного влияния на все системы организма-опухоленосителя, вероятно, оно будет усиливать гипоксию опухоли.

Главный фактор, способствующий выживанию эритроцитов, — их способность деформироваться. Деформируемость эритроцитов определяет реологические свойства крови, характеризуется значительной вариабельностью формы эритроцитов и зависит от трёх основных факторов: эластичности мембраны, внутренней вязкости содержимого клеток, отношения поверхности клеток к их объёму.

Интерес к изучению деформируемости эритроцитов обусловлен тем, что ригидные эритроциты способны окклюзировать часть капиллярного русла и таким образом блокировать кровообращение в системе микроциркуляции. В публикациях, посвящённых изучению морфологических параметров эритроцитов при канцерогенезе, представлены экспериментальные данные и результаты, полученные при некоторых локализациях опухоли. Последние позволяют предполагать значение биологического портрета опухоли в изменении спектра морфологических характеристик эритроцитов циркулирующей крови организма-опухоленосителя [5–6].

Цель исследования — изучить морфологию циркулирующих эритроцитов у больных РЯ III стадии.

Объектом исследования послужили эритроциты периферической крови первичных больных РЯ (n=25), находившихся на III стадии по классификации Международной федерации акушеров-гинекологов (FIGO — от англ. International Federation of Gynecology and Obstetrics). Подбор пациенток проводили по строго определённым критериям:
– возраст 48–60 лет (включительно);
– отсутствие острых воспалительных заболеваний;
– отсутствие в анамнезе хирургических вмешательств давностью менее года (включая стоматологические).

Больные были обследованы в гинекологическом отделении Ульяновского областного клинического онкологического диспансера. В контрольную группу вошли 25 соматически здоровых женщин. Информированное письменное согласие было получено у всех больных.

Исследование когортное, проведено согласно требованиям комиссии по этике Института медицины, экологии и физической культуры ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный университет» (протокол №3 от 15.03.2015).

Морфологические исследования проводили с использованием световой микроскопии Nikon Eclipse E 200. Эритроциты оценивали по классификации Г.И. Козинца [7], согласно которой клетки с признаками эхиноцитарной трансформации (дискоциты, дискоциты с одним выростом, дискоциты с гребнем, дискоциты с множественными выростами, эритроциты в виде тутовой ягоды) относят к обратимо деформированным, а куполообразные эритроциты, сфероциты с гладкой поверхностью, сфероциты с шипиками на поверхности, эритроциты в виде «спущенного мяча», дегенеративные формы эритроцитов — к необратимо деформированным формам. Количество эритроцитов с неизменённой и изменённой формами выражали в процентах, подсчёт производили на 300 эритроцитов.

Были использованы следующие расчётные индексы [7].

1. Индекс трансформации (ИТ) — количественная оценка соотношения патологических и нормальных форм эритроцитов:

ИТ=(ОД%+НД%)/Д%,

где Д% — процент дискоцитов; ОД% — процент обратимо деформированных эритроцитов; НД% — процент необратимо деформированных эритроцитов.

2. Индекс обратимой трансформации (ИОТ):

ИОТ=ОД%/Д%.

3. Индекс необратимой трансформации (ИНОТ):

ИНОТ=НД%/Д%.

Исследование топологии эритроцитов у больных РЯ III стадии и контрольной группы проводили на атомно-силовом микроскопе Solver Pro (NT-MDT, Зеленоград, Россия) в полуконтактном режиме. Получали как 2D-, так и 3D-изображение. Были использованы фирменные кремниевые зонды с жёсткостью 0,2 Н/м, радиус закругления кончика зонда составлял около 10 нм.

Во всех исследуемых группах оценивали ригидность мембраны эритроцита по модулю Юнга. Для его вычисления (программное обеспечение Nova, NT-MDT, Россия) снимают кривые DFL (z) в центральной части каждой клетки. Затем на полученных силовых кривых находят значения DX (нм), DY (нН), Y (нН), согласно которым производят расчёт глубины проникновения зонда в образец:

x=ΔZ∙(SetPoint−DFL0).

Расчёт силы прижатия зонда к образцу производили согласно закону Гука (F=k∙x) с последующим расчётом модуля Юнга [8], согласно теории Герца, описывающей контактную деформацию двух тел. Число точек в скане составляло 600. Поле сканирования имело размеры 100×100, 50×50 мкм.

При статистическом анализе полученные данные представляли как медиану с интерквартильным размахом Ме (Q1, Q2, Q3) или вычисляли среднее значение определяемых показателей и стандартное отклонение при нормальном распределении. Для оценки различий использовали непараметрический критерий Манна–Уитни, где не требуется наличия нормального распределения сравниваемых групп. Различия считали статистически значимыми при р ≤0,05.

Мы установили статистически значимое (р ≤0,05) снижение количества эритроцитов в циркулирующей крови у больных РЯ по сравнению с показателем у соматически здоровых женщин (4,11±0,190×1012/л против 4,68±0,051×1012/л). В ряде исследований при солидных опухолях различной локализации также отмечено снижение количества эритроцитов циркулирующей крови [9, 10]. Этот факт, а также появление дегенеративных форм эритроцитов в циркулирующей крови организма-опухоленосителя при ряде локализаций опухоли авторы объясняют токсическим влиянием опухоли.

В результате проведённых исследований нами установлено снижение количества двояковогнутых дискоцитов и повышение изменённых эритроцитов — эхиноцитов, стоматоцитов, сфероцитов (табл. 1). Эхиноцит считают обратимо деформируемым до стадии потери мембранного вещества [11].

 

Таблица 1. Количество различных форм эритроцитов циркулирующей крови больных раком яичников III стадии и соматически здоровых женщин (%)

Показатели

Контрольная группа

(n=25)

Больные раком яичников

(n=25)

р

Дискоциты

94,2±0,5

32,5±0,5*

0,0003

Эхиноциты

5,6±0,07

59,6±0,2*

0,0003

Стоматоциты

0,12±0,02

3,2±0,3*

0,0005

Сфероциты

0,12±0,02

4,7±0,3*

0,0002

Примечание: *статистически значимые отличия по сравнению с показателями контроля (р ≤0,05).

 

Появление эхиноцитарных форм эритроцитов у больных РЯ при неопластических процессах, возможно, связано с изменением ионной проницаемости мембраны, нарушением работы ионных каналов. После дальнейшего воздействия неоплазмы эхиноцит приобретает сферическую форму. При необратимой трансформации дискоцита в сфероцит выросты плазмолеммы превращаются в произвольные микросферулы [12].

Соотношение нормальных и морфологически изменённых эритроцитов демонстрируют индексы трансформации. Представленные данные (табл. 2) показывают, что у больных РЯ III стадии статистически значимо повышен индекс трансформации эритроцитов относительно группы сравнения. Параллельно отмечено повышение индекса обратимой трансформации и индекса необратимой трансформации эритроцитов у больных РЯ III стадии относительно соматически здоровых женщин.

 

Таблица 2. Показатели соотношения патологических и нормальных форм эритроцитов циркулирующей крови у больных раком яичников и соматически здоровых женщин

Группы

Индекс трансформации эритроцитов, %

Индекс обратимой трансформации эритроцитов, %

Индекс необратимой трансформации эритроцитов, %

Ме (Q1–Q3)

Контрольная (n=25)

0,122

(0,120–0,124)

0,110

(0,100–0,130)

0,011

(0,010–0,013)

III стадия рака яичников (n=25)

2,382*

(2,286–2,670)

0,793*

(0,690–0,952)

1,589*

(1,450–1,760)

Примечание: *статистически значимые отличия по сравнению с показателями контроля (р ≤0,05).

 

Благодаря высокому пространственному разрешению атомно-силового микроскопа на сегодняшний день он служит основным инструментом для изучения рельефа биологического объекта. Метод атомно-силовой микроскопии предоставляет возможность изучать параметры клеток, не прибегая к длительной и сложной фиксации, тем самым минимально искажая получаемую информацию. Он позволяет оценивать упругие свойства поверхности клеток и обеспечивает получение пространственного изображения поверхности [13].

Результаты, полученные с использованием атомно-силовой микроскопии, позволяют предполагать изменение распределения внутриклеточного содержимого (на это указывают профили бокового сечения) и топологии эритроцитов больных РЯ по сравнению с эритроцитами соматически здоровых женщин (рис. 1, 2). Появление обратимых форм — эхиноцитов у больных РЯ III стадии приводит к повышению индекса трансформации эритроцитов и увеличению ригидности (16,2±0,449 кПа против контроля 7,88±0,326 кПа).

 

Рис. 1. Топология (а), боковое сечение профиля (б) и изображение в 3D (в) у соматически здоровых женщин

 

Рис. 2. Топология (а), боковое сечение профиля (б) и изображение в 3D (в) у больных раком яичников

 

Вывод

На фоне появления изменённых форм эритроцитов, увеличения показателей индекса трансформации и возрастании ригидности эритроцитов у больных раком яичников III стадии происходит снижение общего числа эритроцитов в циркулирующей крови по сравнению с соматически здоровыми женщинами.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

A Yu Fedotova

Ulyanovsk State University

Author for correspondence.
Email: tonechkatuzeeva@mail.ru

Russian Federation, Ulyanovsk, Russia

T P Gening

Ulyanovsk State University

Email: tonechkatuzeeva@mail.ru
SPIN-code: 7285-8939

Russian Federation, Ulyanovsk, Russia

T V Abakumova

Ulyanovsk State University

Email: tonechkatuzeeva@mail.ru
SPIN-code: 8564-4253

Russian Federation, Ulyanovsk, Russia

D R Dolgova

Ulyanovsk State University

Email: tonechkatuzeeva@mail.ru
SPIN-code: 7093-3564

Russian Federation, Ulyanovsk, Russia

  1. Vaupel P., Thews O., Hoeckel M. Treatment resistance of solid tumors. Med. Oncol. 2001; 18: 243–259. doi: 10.1385/MO:18:4:243.
  2. Vaupel P., Harrison L. Tumor hypoxia: causa­tive factors, compensatory mechanisms, and cellular response. Oncologist. 2004; 9: 4–9. doi: 10.1634/theoncologist.9-90005-4.
  3. Schito L., Rey S. Hypoxic pathobiology of breast cancer metastasis. Biochim. Biophys. Acta. 2017; 1868: 239–245. doi: 10.1016/j.bbcan.2017.05.004.
  4. Wolff M., Kosyna F.K., Dunst J. et al. Impact of hypoxia inducible factors on estrogen receptor expression in breast cancer cells. Arch. Biochem. Biophys. 2017; 613: ­23–30. doi: 10.1016/j.abb.2016.11.002.
  5. Siprov A.V., Solov'eva M.A. Morphofunctional state of erythrocytes of rats with carcinoma Walker-256 in combined use of docetaxel and ximedon. Byulleten' eksperimental'noy biologii i meditsiny. 2017; (7): 56–60. (In Russ.)
  6. Sladkova E.A., Skorkina M.Yu., Zabinyakov N.A. Мorphological and functional peculiarities of blood cells at tumor growth condition. Biomeditsina. 2013; (3): 63–67. (In Russ.)
  7. Kozinets G.I., Pogorelov V.M., Shmarov D.A. et al. Kletki krovi. Sovremennye tekhnologii ih analiza. (Blood cells. Modern technologies of their analysis.) Moscow: Triada-Farm. 2002; 200 p. (In Russ.)
  8. Henderson R.M., Oberleithner H. Pushing, pulling, dragging, and vibrating renal epithelia by using atomic forse microscopy. AJP Renal physiol. 2000; 278 (5): 689–701. doi: 10.1152/ajprenal.2000.278.5.F689.
  9. Dauletpaeva Zh.O., Demina E.V., Pan'shina S.S. State of peripheral red blood parameters in the presence of lung tumors. Sci. Time. 2016; (5): 159–160. (In Russ.)
  10. Pumpur A.S. Role of the assessing the parameters of a complete blood count, biochemical blood assay and hemistasiograms in patients with colorectal cancer. Koloproktologiya. 2017; (3S): 64. (In Russ.)
  11. Kozinets G.I., Vysotskiy V.V., Pogorelov V.M. Krov' i infekciya. (Blood and infection.) Moskow: Triada-farm. 2001; 182 p. (In Russ.)
  12. Novitskiy V.V., Stepovaya E.A., Gol'dberg V.E. Eritrotsity i zlokachestvennye novoobrazovanija. (Erythrocytes and malignant neoplasms.) Tomsk. 2000; 286 p. (In Russ.)
  13. Pleskova S.N. Atomno-silovaya mikroskopiya v biologicheskih i medicinskih issledovaniyah. (Atomic force microscopy in biological and medical studies.) Dolgoprudnyy. 2011; 184 p. (In Russ.)

Supplementary files

There are no supplementary files to display.

Views

Abstract - 25

PDF (Russian) - 19

Cited-By


PlumX


© 2019 Fedotova A.Y., Gening T.P., Abakumova T.V., Dolgova D.R.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.


Свидетельство о регистрации СМИ ЭЛ № ФС 77-75008 от 1 февраля 2019 года выдано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор)


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies