Peripheral blood erythrocytes morphology in ovarian cancer

Full Text

Рак яичников (РЯ) занимает одно из ведущих мест по частоте возникновения и смертности среди злокачественных новообразований у женщин репродуктивного возраста.

Сегодня основное внимание исследователей направлено на тканевую гипоксию, возникающую в солидных опухолях в динамике опухолевого прогрессирования [1–2]. При этом указывают на возможность возникновения под влиянием гипоксии протеомных и геномных нарушений в опухолевых клетках, определяющих гетерогенность опухоли и агрессивное течение опухолевого процесса [3–4].

Основной причиной гипоксии опухоли, как правило, бывают нарушения её сосудистой системы. Снижение кислородотранспортной функции циркулирующих эритроцитов при этом не рассматривают, хотя, помимо негативного влияния на все системы организма-опухоленосителя, вероятно, оно будет усиливать гипоксию опухоли.

Главный фактор, способствующий выживанию эритроцитов, — их способность деформироваться. Деформируемость эритроцитов определяет реологические свойства крови, характеризуется значительной вариабельностью формы эритроцитов и зависит от трёх основных факторов: эластичности мембраны, внутренней вязкости содержимого клеток, отношения поверхности клеток к их объёму.

Интерес к изучению деформируемости эритроцитов обусловлен тем, что ригидные эритроциты способны окклюзировать часть капиллярного русла и таким образом блокировать кровообращение в системе микроциркуляции. В публикациях, посвящённых изучению морфологических параметров эритроцитов при канцерогенезе, представлены экспериментальные данные и результаты, полученные при некоторых локализациях опухоли. Последние позволяют предполагать значение биологического портрета опухоли в изменении спектра морфологических характеристик эритроцитов циркулирующей крови организма-опухоленосителя [5–6].

Цель исследования — изучить морфологию циркулирующих эритроцитов у больных РЯ III стадии.

Объектом исследования послужили эритроциты периферической крови первичных больных РЯ (n=25), находившихся на III стадии по классификации Международной федерации акушеров-гинекологов (FIGO — от англ. International Federation of Gynecology and Obstetrics). Подбор пациенток проводили по строго определённым критериям:
– возраст 48–60 лет (включительно);
– отсутствие острых воспалительных заболеваний;
– отсутствие в анамнезе хирургических вмешательств давностью менее года (включая стоматологические).

Больные были обследованы в гинекологическом отделении Ульяновского областного клинического онкологического диспансера. В контрольную группу вошли 25 соматически здоровых женщин. Информированное письменное согласие было получено у всех больных.

Исследование когортное, проведено согласно требованиям комиссии по этике Института медицины, экологии и физической культуры ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный университет» (протокол №3 от 15.03.2015).

Морфологические исследования проводили с использованием световой микроскопии Nikon Eclipse E 200. Эритроциты оценивали по классификации Г.И. Козинца [7], согласно которой клетки с признаками эхиноцитарной трансформации (дискоциты, дискоциты с одним выростом, дискоциты с гребнем, дискоциты с множественными выростами, эритроциты в виде тутовой ягоды) относят к обратимо деформированным, а куполообразные эритроциты, сфероциты с гладкой поверхностью, сфероциты с шипиками на поверхности, эритроциты в виде «спущенного мяча», дегенеративные формы эритроцитов — к необратимо деформированным формам. Количество эритроцитов с неизменённой и изменённой формами выражали в процентах, подсчёт производили на 300 эритроцитов.

Были использованы следующие расчётные индексы [7].

1. Индекс трансформации (ИТ) — количественная оценка соотношения патологических и нормальных форм эритроцитов:

ИТ=(ОД%+НД%)/Д%,

где Д% — процент дискоцитов; ОД% — процент обратимо деформированных эритроцитов; НД% — процент необратимо деформированных эритроцитов.

2. Индекс обратимой трансформации (ИОТ):

ИОТ=ОД%/Д%.

3. Индекс необратимой трансформации (ИНОТ):

ИНОТ=НД%/Д%.

Исследование топологии эритроцитов у больных РЯ III стадии и контрольной группы проводили на атомно-силовом микроскопе Solver Pro (NT-MDT, Зеленоград, Россия) в полуконтактном режиме. Получали как 2D-, так и 3D-изображение. Были использованы фирменные кремниевые зонды с жёсткостью 0,2 Н/м, радиус закругления кончика зонда составлял около 10 нм.

Во всех исследуемых группах оценивали ригидность мембраны эритроцита по модулю Юнга. Для его вычисления (программное обеспечение Nova, NT-MDT, Россия) снимают кривые DFL (z) в центральной части каждой клетки. Затем на полученных силовых кривых находят значения DX (нм), DY (нН), Y (нН), согласно которым производят расчёт глубины проникновения зонда в образец:

x=ΔZ∙(SetPoint−DFL0).

Расчёт силы прижатия зонда к образцу производили согласно закону Гука (F=k∙x) с последующим расчётом модуля Юнга [8], согласно теории Герца, описывающей контактную деформацию двух тел. Число точек в скане составляло 600. Поле сканирования имело размеры 100×100, 50×50 мкм.

При статистическом анализе полученные данные представляли как медиану с интерквартильным размахом Ме (Q1, Q2, Q3) или вычисляли среднее значение определяемых показателей и стандартное отклонение при нормальном распределении. Для оценки различий использовали непараметрический критерий Манна–Уитни, где не требуется наличия нормального распределения сравниваемых групп. Различия считали статистически значимыми при р ≤0,05.

Мы установили статистически значимое (р ≤0,05) снижение количества эритроцитов в циркулирующей крови у больных РЯ по сравнению с показателем у соматически здоровых женщин (4,11±0,190×1012/л против 4,68±0,051×1012/л). В ряде исследований при солидных опухолях различной локализации также отмечено снижение количества эритроцитов циркулирующей крови [9, 10]. Этот факт, а также появление дегенеративных форм эритроцитов в циркулирующей крови организма-опухоленосителя при ряде локализаций опухоли авторы объясняют токсическим влиянием опухоли.

В результате проведённых исследований нами установлено снижение количества двояковогнутых дискоцитов и повышение изменённых эритроцитов — эхиноцитов, стоматоцитов, сфероцитов (табл. 1). Эхиноцит считают обратимо деформируемым до стадии потери мембранного вещества [11].

 

 

Появление эхиноцитарных форм эритроцитов у больных РЯ при неопластических процессах, возможно, связано с изменением ионной проницаемости мембраны, нарушением работы ионных каналов. После дальнейшего воздействия неоплазмы эхиноцит приобретает сферическую форму. При необратимой трансформации дискоцита в сфероцит выросты плазмолеммы превращаются в произвольные микросферулы [12].

Соотношение нормальных и морфологически изменённых эритроцитов демонстрируют индексы трансформации. Представленные данные (табл. 2) показывают, что у больных РЯ III стадии статистически значимо повышен индекс трансформации эритроцитов относительно группы сравнения. Параллельно отмечено повышение индекса обратимой трансформации и индекса необратимой трансформации эритроцитов у больных РЯ III стадии относительно соматически здоровых женщин.

 

 

Благодаря высокому пространственному разрешению атомно-силового микроскопа на сегодняшний день он служит основным инструментом для изучения рельефа биологического объекта. Метод атомно-силовой микроскопии предоставляет возможность изучать параметры клеток, не прибегая к длительной и сложной фиксации, тем самым минимально искажая получаемую информацию. Он позволяет оценивать упругие свойства поверхности клеток и обеспечивает получение пространственного изображения поверхности [13].

Результаты, полученные с использованием атомно-силовой микроскопии, позволяют предполагать изменение распределения внутриклеточного содержимого (на это указывают профили бокового сечения) и топологии эритроцитов больных РЯ по сравнению с эритроцитами соматически здоровых женщин (рис. 1, 2). Появление обратимых форм — эхиноцитов у больных РЯ III стадии приводит к повышению индекса трансформации эритроцитов и увеличению ригидности (16,2±0,449 кПа против контроля 7,88±0,326 кПа).

 

Рис. 1. Топология (а), боковое сечение профиля (б) и изображение в 3D (в) у соматически здоровых женщин

 

Рис. 2. Топология (а), боковое сечение профиля (б) и изображение в 3D (в) у больных раком яичников

 

Вывод

На фоне появления изменённых форм эритроцитов, увеличения показателей индекса трансформации и возрастании ригидности эритроцитов у больных раком яичников III стадии происходит снижение общего числа эритроцитов в циркулирующей крови по сравнению с соматически здоровыми женщинами.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

About the authors

A Yu Fedotova

Ulyanovsk State University

Author for correspondence.
Email: tonechkatuzeeva@mail.ru
Russian Federation, Ulyanovsk, Russia

T P Gening

Ulyanovsk State University

Email: tonechkatuzeeva@mail.ru
SPIN-code: 7285-8939
Russian Federation, Ulyanovsk, Russia

T V Abakumova

Ulyanovsk State University

Email: tonechkatuzeeva@mail.ru
SPIN-code: 8564-4253
Russian Federation, Ulyanovsk, Russia

D R Dolgova

Ulyanovsk State University

Email: tonechkatuzeeva@mail.ru
SPIN-code: 7093-3564
Russian Federation, Ulyanovsk, Russia

References

Supplementary files