Metabolomic research in medicine

Full Text

­Одно из новых направлений в генетике и молекулярной биологии - метаболомика, которая может помочь практикующим врачам в диагностике и прогнозе различных заболеваний [29]. Метаболомика - область науки, изучающая конечные и промежуточные продукты обмена веществ в биологической системе, будь то клетка, орган или организм в целом [13]. Метаболом, или метаболический профиль, представляет собой совокупность всех низкомолекулярных метаболитов (<1500 Да) биологического образца, являясь уникальным химическим «отпечатком пальцев», специфичным для процессов, протекающих в живых клетках [8]. Идея применения метаболического профиля в диагностике заболеваний была выдвинута Linus Pauling и соавт. ещё в 1971 г. Они предложили производить анализ выдыхаемого воздуха пациентов методом газовой хроматографии в целях выявления метаболических изменений при определённых заболеваниях и выявили более 200 различных летучих органических соединений (ЛОС) [23]. В январе 2007 г. учёные университета Альберта и университета Калгари завершили исследование метаболомического профиля человека. Они каталогизировали около 2500 метаболитов, 1200 лекарств и 3500 компонентов пищи, которые могут быть найдены в биологических образцах человека [35]. В настоящее время описаны метаболомы биологических жидкостей человека и животных - мочи, спинномозговой жидкости, плазмы и т.д. Последние исследования показали, что метаболомика может выявить специфические признаки болезни, так называемые биомаркёры, которые в будущем сыграют большую роль в диагностике и прогнозе заболевания [6, 10, 30]. Исследования метаболического профиля выполняют, как правило, с использованием гибридного метода анализа - сочетания газовой (ГХ) или жидкостной (ЖХ) хроматографии и масс-спектрометрии (МС) или спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР-спектроскопия). ГХ - универсальный метод разделения смеси веществ, испаряющихся без разложения [1, 29]. Моча и мокрота богаты летучими органическими метаболитами, потенциальными биомаркёрами многих заболеваний, их получение не требует применения инвазивных процедур (в отличие от забора крови или спинномозговой жидкости) [11, 15, 29]. В метаболомических исследованиях выделение ЛОС из образца чаще всего производят способом твердофазной микроэкстракции (ТФМЭ). Метод основан на сорбции компонентов газовой фазы образца на нить с полимерным покрытием с её последующей термической десорбцией в предварительно нагретом инжекторе газового хроматографа. Эта методика имеет несколько преимуществ перед традиционными методами извлечения растворителем: ТФМЭ не требует существенных временных затрат, удобна, высокочувствительна, проводится без использования растворителя [29]. Высокого уровня по информативности метаболомических данных достигли две технологии: МС и ЯМР-спектроскопия [22, 26]. Они имеют свои специфические преимущества и недостатки. Основным преимуществом МС является чувствительность: современный уровень масс-спектрометров может обнаружить аналиты в фемтомолярном (10-15) и аттомолярном (10-18) диапазоне. Связь МС с ЖХ или ГХ позволяет измерять сотни отдельных метаболитов в пределах одного образца и вместе с постоянно пополняемыми базами данных делает идентификацию этих метаболитов более рутинной. Одна из слабых сторон МС - определение концентрации искомого метаболита. Также к недостаткам можно отнести и тот факт, что интенсивность МС-сигнала любого соединения зависит от подготовки образца и его молекулярного окружения [34]. Основные слабые стороны МС являются основными сильными сторонами ЯМР-спектроскопии. Высота пика конкретного метаболита в ЯМР-спектре напрямую связана с концентрацией ядер химического соединения, что делает его количественное определение в сложной смеси очень точным. Другой недооценённой характерис­тикой ЯМР-спектроскопии является её универсальность для анализа метаболитов в жидком состоянии (таких, как сыворотка крови, моча и т.д.), в неповреждённых тканях (например, опухоли) или в естественных условиях (in vivo) [34]. Хотя метаболомика - относительно молодое направление по сравнению с геномикой и протеомикой, её уже применяют в разнообразных областях медицины, в том числе при скрининге патологии новорождённых, в токсикологии и фармакологии. В сравнении с геномикой и протеомикой на метаболомику возлагают большие надежды в поиске биомаркёров заболеваний, в первую очередь онкологических. К примеру, Sreekumar и соавт. выделили метаболический профиль 42 образцов ткани, 110 образцов мочи и 110 образцов плазмы крови пациентов, страдающих доброкачественными заболеваниями простаты, ограниченной и распространённой формой рака предстательной железы. Они в состоянии отличить эти три состояния на основе данных ГХ и ЯМР-спектроскопии. Также ими обнаружено, что концентрация конкретного метаболита - саркозина (в том числе в моче) - была существенно увеличена на этапе метастатического прогрессирования рака предстательной железы [30]. В исследовании рака яичника лаборатория доктора Fiehn провела метаболомический скрининг тканей 66 образцов инвазивной формы рака и 9 образцов доброкачественных опухолей яичников [9]. Исследователи обнаружили различие между данными группами образцов более чем по 50 метаболитам. Многие из этих метаболитов играют важную роль в обмене пуринов, пиримидинов, глицеролипидов и в энергетическом обмене. Xue и соавт. использовали этот метод для исследования ЛОС крови, связанных с раком печени. Было установлено, что группа больных раком печени и контрольная группа различались по 19 ЛОС крови (р <0,05). Из этих 19 соединений 3 (гексанал, 1-октен-3-ол и октан) были найдены в повышенных концентрациях в крови группы больных раком печени по сравнению с контрольной группой [37]. Чтобы исследовать летучие метаболиты мочи как потенциальные биомаркёры рака C.L. Silva и соавт. качественно и количественно проанализировали образцы мочи 33 больных злокачественными новообразованиями (14 больных лейкозом, 12 - колоректальным раком, 7 - лимфомами) и 21 здорового пациента, используя ТФМЭ-ГХ-МС. В общей сложности в онкологической и контрольной группах идентифицировано 82 летучих метаболита, принадлежащих к различным химическим классам. Производные бензола, терпеноиды и фенолы были наиболее распространёнными классами в онкологической группе, тогда как кетоны и серосодержащие вещества оказались основными классами соединений, выделенными из мочи здоровых пациентов [29]. Метод идентификации летучих биомаркёров даёт возможность дополнить гистопатологическую характеристику опухоли метаболомическими данными. M.V. Brown и соавт. разработали методику параллельного выделения метаболитов и гистологического анализа неповреждённых биоптатов. Ими также было обнаружено 69 метаболитов, отличающих раковую опухоль почки от образцов доброкачественной опухоли, и определены 83 метаболита, статистически значимо (р <0,05) отличающих биоптаты рака от доброкачественных образований предстательной железы. Выделение определённых метаболических характеристик опухолевой ткани, по данным M.V. Brown и соавт., может свидетельствовать не только о стадии рака, но и о степени злокачественности [4]. Ряд других метаболомических исследований указывает на возможность построения прогностической модели на наличие у пациентов хронической инфекции путём обнаружения ЛОС-биомаркёров микроорганизмов в биологических средах (мокроте, крови, моче, выдыхаемом воздухе и др.). ЛОС синтезируются всеми микроорганизмами, являясь частью их нормального обмена веществ. Типы и классы производимых микробами ЛОС обширны и включают жирные кислоты и их производные (например, углеводороды, алифатические спирты и кетоны), ароматические соединения, азотсодержащие вещества и летучие соединения серы [28]. P.C. Goeminne и соавт. определяли ЛОС, вырабатываемые Pseudomonas aeruginosa, в мокроте больных муковисцидозом (кистозным фиброзом) лёгких методом ТФМЭ-ГХ-МС [11]. Они обнаружили связь между присутствием Pseudomonas aeruginosa в организме пациента и высокой концентрацией терпенов 1-ундецена, 1-α-пинена и соединений додекана, терпинен-4-ола и 2,2,6-триметил-октана в образцах мокроты. На основе обзора литературы и своих результатов авторы пришли к выводу, что не одно ЛОС, а их сочетание может свидетельствовать о наличии Pseudomonas aeruginosa в организме [11]. Колонии Aspergillus fumigates из дыхательных путей пациентов с хроническими заболеваниями лёгких были ассоциированы с присутствием летучего вещества 2-пентилфурана при анализе выдыхаемого воздуха методом ГХ-МС, что в настоящее время разрабатывается в качестве нового диагнос­тического дыхательного теста [7]. Метаболомика как современная методика также может помочь определить значимость экологического воздействия экзогенных ЛОС на здоровье человека. Источники ЛОС включают табачный дым, нефтепродукты и хлорированную воду [3]. Длительная экспозиция токсичных ЛOC может увеличить риск лейкоза, рака мочевого пузыря, врождённых дефектов и нейрокогнитивных нарушений [16, 27]. Индивидуальные особенности в поглощении, распределении, метаболизме и выделении экологических ядов человеком усложняет оценку экспозиции ЛOC. Методом ТФМЭ-ГХ-МС B.C. Blount и соавт. определили 14 галогенизированных алканов, 5 галогенизированных алкенов, 10 соединений ароматического ряда и некоторых других ЛОС в образцах человеческой крови. В большинстве этих образцов данный метод зарегистрировал в крови бензол, 1,4-дихлорбензол, этилбензол, толуол, м/п-ксилол. Некоторые из образцов крови содержали также 13 дополнительных соединений: стирол, хлороформ, o-ксилол, тетрахлорэтен, 2,5-диметилфуран, метил-трет-бутиловый эфир, бромдихлорометан, дибромхлорметан, бромоформ, тетрахлорметан, трихлорэтан, метиленхлорид и 1,2-дихлорэтан [3]. В настоящее время метаболомика имеет широкое применение в различных областях науки, в том числе и в экспериментальной медицине. Сегодня различные клеточные культуры широко используют в науке, эксперименты in vitro применяют в таких фундаментальных исследованиях, как характеристика метаболизма клетки [38] или анализ митоза [36]. В других научных работах культивированные клетки используют как тест-системы для оценки воздействия химиотерапевтических препаратов на клетку [14]. Для поддержания клеточных культур необходимо добавление в питательные среды животной сыворотки, например сыворотки эмбриона телёнка. К сожалению, животные сыворотки имеют ряд недостатков, таких как возможное загрязнение образцов и высокая себестоимость. Для определения влияния искусственных заменителей сыворотки на жизнедеятельность и метаболизм культивируемых клеток M. Hartmann и соавт. использовали метод определения летучих метаболомов опухолевых клеток с помощью ГХ-МС [12]. В целом было проанализировано около 50 ЛОС и установлено, что метаболизм культивируемых клеток сильно меняется при добавлении в питательную среду заменителя животной сыворотки. Таким образом, учёные пришли к выводу, что для роста и метаболизма опухолевых клеток и, соответственно, достоверности экспериментов с культурами клеток необходимо добавление в питательную среду животной сыворотки [12]. Как отмечено выше, ГХ в сочетании с МС является наиболее «естественной» комбинацией для исследования метаболомического профиля биологических образцов. В своей работе G. Martano и соавт. стремились оптимизировать метод ГХ-MС с предшествующей ТФМЭ для определения концентрации летучих продуктов расщепления β-каротина в клеточной культуре [17]. Известно, что β-каротин, предшественник витамина А, уменьшает риск сердечно-сосудистых болезней, катаракты и дегенерации макулы. Однако было замечено, что при ежедневном приеме 20-30 мг β-каротина пациентами с большим стажем курения на 16-28% увеличилась заболеваемость раком лёгкого, влекущая за собой повышенный риск смертности по сравнению с плацебо-контролем. Этот кажущийся парадокс был связан с прооксидантными и проканцерогенными свойствами продуктов распада β-каротина в сочетании с высоким парциальным давлением кислорода, окислительным стрессом и высоким уровнем реактивных форм кислорода в ткани лёгкого курильщиков [2, 5, 19, 20]. Очевидно, продукты распада β-каротина образуются эксцентральным (неферментативным) расщеплением в богатой радикалами окружающей среде лёгкого курильщика, и эти продукты распада β-каротина могут провоцировать канцерогенез разнообразными путями. Набор продуктов распада β-каротина содержит β-ионон, циклоцитраль, дигидроактинидиолид и 1,1,6-триметилтетралин. Эти продукты распада β-каротина являются пусковым механизмом в развитии скрытых опухолей [19, 21]. Таким образом, представленный метод позволил определить биологически значимые летучие продукты распада β-каротина в клеточных системах in vitro [17]. В другой работе с целью улучшения понимания процесса посмертного распада позвоночных животных S. Paczkowski и S. Schutz объединили результаты исследований биохимической структуры ЛОС, обнаруженных во время процесса разложения [18]. Ими выдвинуто предположение о возможности существования зависимой от времени структуры ЛОС некротических масс, что может быть использовано в таких областях, как судебная медицина и диетология. Поиск жертв стихийных бедствий, например погребённых при землетрясениях [32], может быть ускорен с помощью методики идентификации ЛОС [31]. В пищевой промышленности применение детектора для регистрации ранних посмертных ЛОС позвоночных может помочь в определении степени порчи или оценке сроков хранения рыбных и мясных продуктов. Rajamaki и соавт. нашли большое количество диметилдисульфида (образующегося из метантиола) в образцах испорченных цып­лят-бройлеров [24]. Таким образом, метантиол или связанные метилированные сульфиды могут быть маркёрами неправильного хранения мясных продуктов. Несмотря на всё вышесказанное, в метаболомике существует серьёзная проблема - все биологические образцы содержат многочисленные соединения с различными физико-химическими свойствами и в широком диапазоне концентраций, что делает метаболомическое профилирование достаточно сложной задачей, требующей улучшения метода с точки зрения чувствительнос­ти и специфичности. Полная двухмерная ГХ (ГХ-ГХ) с время-пролётной МС - относительно новая методика с очень высокой разрешающей способностью, которая была опробована в метаболомических исследованиях. Используя колонки с двумя разными стационарными фазами (например, полярная-неполярная) в одной процедуре, ГХ-ГХ добавляет второе хроматографическое разделение компонентов исследуемого образца. При ГХ-ГХ-анализе пики веществ достаточно разграничены, чтобы следовые компоненты можно было легко детектировать и измерять их концентрацию. S.M. Rocha и соавт. применили полную ГХ-ГХ с время-пролётной МС в сочетании с ТФМЭ образца для всестороннего изу­чения летучих соединений мочи человека [25]. Было идентифицировано около 300 соединений, которые были распределены по следующим химическим группам: углеводороды, амины, амиды, сложные эфиры, кетоны, альдегиды, спирты, карбоновые кислоты, эфиры, нитрилы, галогениды, сульфиды, тиолы, терпеноиды и гетероцик­лические соединения. Это наиболее полная на сегодняшний день информация о составе человеческой мочи, которая представляет собой ценные данные для будущих исследований в клинической медицине. Полная ГХ-ГХ с время-пролётной МС образцов мочи была применена K.А. Kouremenos и соавт. для диагностики врождённых нарушений обмена веществ у детей и детального анализа сложных профилей, которые часто связаны с этими расстройствами [15]. Врождённые нарушения обмена веществ можно диагностировать на основе обнаружения в моче аномально повышенных органических кислот, связанных с соответствующей ферментопатией. Повышенная чувствительность метода ГХ-ГХ с время-пролётной МС позволила обнаружить следовые уровни многих органичес­ких кислот, присутствующих в образцах, что бывает довольно сложно сделать при использовании подхода одномерного разделения ГХ. Метилмалоновая и метиллимонная кислоты служат основными маркёрами метилмалоновой ацидемии. В свою очередь адипиновая и 3-метил-адипиновая кислоты не связанны с метилмалоновой ацидемией, но могут отражать вторичное торможение других метаболических путей. Гексаноилглицин является основным маркёром недостаточности среднецепочечной ацил-КoA дегидрогеназы. 3-Метил-кротонил-глициновая и 3-гидрокси-изовалериановая кислоты - индикаторы недостаточности 3-метилкротонил КоА карбоксилазы [15]. Таким образом, на метаболомику возлагаются большие надежды в поиске биомаркёров заболеваний, таких как злокачес­твенные новообразования, наследственные и инфекционные заболевания. В заключение отметим, что применение многих из вышеописанных методов по-прежнему в значительной степени ограничивается научно-исследовательской работой, но предполагается, что в будущем профилирование ЛОС «у постели больного» откроет возможность быстрой характерис­тики заболевания, обеспечивая жизненно важной информацией пациентов и медицинских работников [33].

About the authors

R R Furina

Republican Clinical Hospital, Yoshkar-Ola, Russia

Email: furina_raisa@mail.ru

N N Mitrakova

Republican Clinical Hospital, Yoshkar-Ola, Russia

V L Ryzhkov

Republican Clinical Hospital, Yoshkar-Ola, Russia

I K Safiullin

Mari-Turek Central Regional Hospital, Mari-Turek, Russia

References

Supplementary files