Study of immunogenic properties of the Alternaria tenuis mould

Full Text

Alternaria tenuis — широко распространенный в природе сапрофитный и фитопатогенный микроскопический гриб. Одним из первых среди плесневых грибов этот вид стал известен как причина аллергических заболеваний. Он входит в первую пятерку наиболее значимых грибковых аллергенов [5]. Аллергеноактивные фракции из спор и мицелия Alternaria tenuis, попадающие в респираторный тракт человека, формируют преимущественно гиперчувствительность немедленного типа [3, 4]. В целях диагностики аллергии к данному виду гриба была разработана технология получения диагностического аллергена [1]. Диагностическая доза препарата (200 PNU в 0,05 мл) вызывает преимущественно реакции немедленного типа (до 90% случаев), что вполне соответствует реагиновому иммунному ответу на неинфекционные аллергены [2].

Для применения полученного аллергена Alternaria tenuis в лечебной практике возникла необходимость дополнительного изучения его иммуногенных свойств, а также соответствия реакций иммунной системы на биомассу гриба и растворимый препарат. С этой целью нами проведен сравнительный анализ иммунологического ответа морских свинок на однократное введение биомассы гриба Alternaria tenuis и изучаемого аллергена на разных сроках сенсибилизации, что позволит сделать вывод о соответствии антигенного спектра разработанного препарата антигенам данного гриба.

Во всех опытах использовали производственный штамм гриба Alternaria tenuis V—I. Изготовление аллергена проводили по разработанному экспериментально-производственному регламенту: состав аллергена соответствовал ВФС-42127-ВС-87.

Дезинтеграт биомассы гриба получали методом ручного растирания воздушно-сухого мицелия гриба с последующей экстракцией 0,05 М фосфатным буфером pH 7,0 в течение 18 часов при +4°С. Препараты изучали методом гель-хроматографии на сефадексе G-100 с определением в каждой фракции содержания белка, углеводов, иммунохимических свойств в реакции иммунодиффузии (РИД) с гомологичной антисывороткой и постановкой кожно-аллергических проб на сенсибилизированных морских свинках. Сенсибилизацию морских свинок для постановки кожных проб проводили однократным введением дезинтеграта биомассы в смеси с неполным адъювантом Фрейнда (1:1) в подлопаточную область из расчета 15 мг биомассы на 100 г массы тела животного. Кожные пробы ставили на 21-е сутки сенсибилизации. Для каждой серии опытов использовали не менее 10 животных.

Иммуноморфологические исследования проведены на 45 морских свинках-самцах массой тела от 300 до 400 г (из них 40 подопытных и 5 контрольных животных). Подопытные животные были разделены на 2 серии. Морским свинкам 1-й серии вводили биомассу плесневого гриба Alternaria tenuis с неполным адъювантом Фрейнда (в соотношении 1:1) по 0,5 мл в каждое бедро подкожно из расчета 10 мг биомассы на одно животное. Морским свинкам 2-й серии вводили аллерген гриба с неполным адъювантом Фрейнда (в соотношении 1:1) по 0,3 мл в каждое бедро подкожно из расчета по 0,06 мг белкового азота на одно животное. Контрольным морским свинкам вводили только адъювант Фрейнда по 0,5 мл. Животных умерщвляли под эфирным наркозом на 7, 14 и 22-е дни сенсибилизации.

При вскрытии животных определяли весовой индекс (ВИ) тимуса, селезенки и надпочечников. Помимо этих органов гистологическому и гистохимическому исследованию (после фиксации кусочков органов в смеси Карнуа) подвергали паховые и парааортальные (забрюшинные) лимфатические узлы, регионарные к месту введения антигена. Парафиновые срезы органов окрашивали гематоксилин-эозином, по Мак Манусу на полисахариды (ШИК-реакция) и по Браше на РНК.

Проведенная гель-хроматография на сефадексе G-100 дезинтеграта нативной биомассы и разработанного аллергена Alternaria tenuis показала, что оба образца содержали по две основные фракции, обладающие иммунохимическими и аллергенными свойствами, примерно совпадающие по молекулярной массе (см. табл.). В составе гель-хроматографических фракций дезинтеграта имели место и низкомолекулярные компоненты, не обладающие иммунохимической и аллергенной активностью. По биохимическому составу во фракциях дезинтеграта отмечено преобладание в 5—10 раз содержания углеводных компонентов по сравнению с аналогичными фракциями разработанного нами препарата.

Различия в составе образцов можно объяснить тем, что по разработанной нами технологии получения аллергена предусмотрено удаление пигментов, токсических веществ и низкомолекулярных фракций препарата. Полученные результаты согласуются с данными ряда авторов [6, 7], по которым аллергеноактивные фракции Alternaria tenuis представляют собой гликопротеиды с молекулярной массой выше 20 кДа.

В опытной серии животных, которым вводили биомассу гриба, выявлены определенные иммуноморфологические изменения в динамике сенсибилизации. ВИ тимуса на всех сроках сенсибилизации был увеличен в пределах 0,6—0,8 (в контроле — 0,5). Дольки вилочковой железы разной величины имели отчетливую границу между корковым и мозговым веществом. Увеличение ВИ органа происходило прежде всего за счет расширения коркового слоя. Характерно и увеличение числа телец Гассаля в мозговом слое, хотя их количество варьировало в разных дольках от 1—2 до 8—10 (в среднем 5—6 телец на дольку), причем половина телец были кистозно изменены и заполнены «гематоксилиновыми тельцами». Однако на 22-й день сенсибилизации в кистозно расширенных тельцах превалировали «жемчужины» из полуороговевших клеток.

ВИ селезенки был также увеличен до 1,5 по сравнению с контролем (1,1) Количество фолликулов (на площадь поперечного среза органа) нарастало от 10—12 в контроле до 16—18 на 7-й день сенсибилизации и до 21—25 на 14—22-й дни сенсибилизации. В половине фолликулов у подопытных морских свинок определялись реактивные центры (РЦ). Высокий уровень митотической активности отмечен в РЦ фолликулов и в мелких колониях плазматических клеток в красной пульпе на 7-й день опыта. Далее реакция РЦ затухала, а у колоний плазматических клеток становилась интенсивнее. На 7—14-й дни сенсибилизации синусы красной пульпы были узкими, в них выявлялись в основном полинуклеары с бедной ШИК-положительной зернистостью в цитоплазме. На 22-й день сенсибилизации синусы селезенки расширялись, и их клеточный состав становился более полиморфным.

 

Результаты изучения гель-хроматографических фракций препаратов Alternaria tenuis

Препараты	№№ фракций	Молекулярная масса, кДа	Состав — белок: углеводы	Активность в РИД с гомологичной антисывороткой	Кожно-аллергические пробы на морских свинках в мм (средняя из 10 значений)
Дезинтеграт биомассы	I	100	1:10	3+	12,4±1,2
	II	50—70	1:5	+	10,7±0,8
	III	10	1:2	отр.	отр.
Разработанный аллерген	I	100	1:1	3+	11,8±1,4
	II	60—70	1:1	2+	12,0±1,1

 

Большинство поясничных лимфоузлов характеризовались гиперплазией фолликулов (до 12— 14 в срезе) с увеличенными РЦ с 14-го дня опыта, а также выраженной плазматизацией мякотных шнуров с выбросом большого числа лимфоцитов в синусы мозгового слоя. В небольшой части поясничных лимфоузлов имела место выраженная гиперплазия томус-зависимой паракортикальной зоны, а в корковом слое этих узлов (между фолликулами) определялось много пиронинофильных бластных клеток.

В паховых лимфоузлах количество фолликулов с РЦ было в 2 раза меньше, чем в поясничных лимфатических узлах, и в них превалировала гиперплазия коры и паракортекса с 7-го дня сенсибилизации. В синусах мозгового слоя было мало лимфоцитов, но определялась пиронинофилия цитоплазмы макрофагов.

В группе животных, сенсибилизированных аллергеном Alternaria tenuis, морфологическая картина в иммунокомпетентных органах была в общем аналогичной описанному выше. Однако обращало на себя внимание увеличение ВИ вилочковой железы до 1,0—1,25 на 14—22-й дни сенсибилизации. Гиперплазия связана с расширением коркового слоя и высоким уровнем клеточности мозгового слоя. Количество телец Гассаля в дольках колебалось от 1—2 до 7—8, причем половина из них, как и в предыдущей серии опытов, была кистозно трансформирована и заполнена «гематоксилиновыми тельцами» (на 7—14-й дни сенсибилизации) или преимущественно роговыми «жемчужинами» (на 22-й день опыта). Характерно усиление ШИК-положительной реакции в стенке сосудов мозгового слоя долек с 14-го дня сенсибилизации.

ВИ селезенки у морских свинок 2-й серии был также увеличен от 1,5 (на 7 и 22-й дни сенсибилизации) до 1,8 (на 14-й день опыта). Количество фолликулов (на площадь поперечного сечения органа) нарастало от 14—17 (на 7-й день опыта) до 20—25 (на 14—22-й дни сенсибилизации). РЦ в фолликулах, а также значительная пиронинофилия В-зоны фолликулов определялись с 14-го дня сенсибилизации. На всех сроках эксперимента в красной пульпе селезенки превалировали мелкие колонии плазматических клеток, но в целом клеточность красной пульпы была значительной, причем в синусах было много нейтрофилов с ШИК-положительной цитоплазмой.

В поясничных лимфоузлах в 75% случаев преобладал иммунный ответ по гуморальному типу: гиперплазия фолликулов с увеличением РЦ, утолщение мякотных шнуров с накоплением в них плазматических клеток (с 14-го дня сенсибилизации), выход лимфоцитов в синусы. ШИК-положительная окраска цитоплазмы макрофагов в синусах варьировала от ± до 2+ в независимости от уровня плазматизации мякотных шнуров.

В паховых лимфатических узлах число фолликулов с РЦ колебалось от 2 до 5 в поперечном срезе органа. В половине случаев наблюдалась плазматизация мякотных шнуров с выходом лимфоцитов в синусы, а в половине случаев была выражена гиперплазия паракортекса. ШИК-реакция в цитоплазме макрофагов этих узлов также широко варьировала и не зависела от уровня иммунного ответа.

В обеих сериях подопытных животных ВИ надпочечников (0,4—0,45) практически не отличался от такового у контрольных животных (0,4—0,5). В 2/3 случаев, когда имела место очаговая гиперплазия клубочковой зоны в паховых лимфатических узлах, превалировал иммунный ответ по клеточному типу (выраженная гиперплазия паракортикальной зоны).

Таким образом, разработанный аллерген Alternaria tenuis содержал практически все иммунологически активные и аллергенные компоненты гриба. Результаты сравнительного морфологического изучения иммунокомпетентных органов двух серий животных, которым вводили биомассу гриба или очищенный аллерген Alternaria tenuis, показали в целом сходство иммуноморфологического ответа по характеру и срокам развития: преобладание гуморального иммунного ответа в поясничных лимфоузлах и клеточного иммунного ответа в паховых лимфоузлах, корреляцию между гиперплазией паракортикальной зоны в паховых лимфоузлах и очаговой гиперплазией клубочковой зоны в надпочечниках. Отмечены лишь большая гиперплазия тимуса и значительная клеточность красной пульпы селезенки с накоплением ШИК-положительных лейкоцитов в синусах при введении аллергена (на 14—22-й дни сенсибилизации) .

Отсутствие различий в иммуноморфологическом ответе на очищенный аллерген Alternaria tenuis и биомассу этого гриба подтверждает сходство антигенных спектров разработанного аллергена и гриба.

About the authors

V. P. Nefedov

Kazan Institute for Postgraduate Medical Education; Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com

Department of Clinical Laboratory Diagnostics, Laboratory for the Development of Fungal Allergens

Russian Federation, Kazan; Kazan

N. I. Glushko

Kazan Institute for Postgraduate Medical Education; Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: info@eco-vector.com

Department of Clinical Laboratory Diagnostics, Laboratory for the Development of Fungal Allergens

Russian Federation, Kazan; Kazan

O. V. Nefedov

Kazan Institute for Postgraduate Medical Education; Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: info@eco-vector.com

Department of Clinical Laboratory Diagnostics, Laboratory for the Development of Fungal Allergens

Russian Federation, Kazan; Kazan

V. M. Lukashkov

Kazan Institute for Postgraduate Medical Education; Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: info@eco-vector.com

Department of Clinical Laboratory Diagnostics, Laboratory for the Development of Fungal Allergens

Russian Federation, Kazan; Kazan

References

Supplementary files