Molecular genetic approaches to the prevention, diagnosis and treatment of neoplasms

Abstract

The last 25 years have been marked by truly revolutionary events in fundamental oncology. The rapid development of molecular genetics, in particular, the discovery of oncogenes and antioncogenes, has radically changed the understanding of the mechanisms of the onset of neoplasms [2, 15]. Nevertheless, it is generally accepted that progress in the theoretical field has had little effect on the state of affairs in clinical oncology. The content of this review is intended to demonstrate the groundlessness of such assertions.

Full Text

Последние 25 лет были отмечены поистине революционными событиями в фундаментальной онкологии. Бурное развитие молекулярной генетики, в частности открытие онкогенов и антионкогенов, кардинально видоизменило представления о механизмах возникновения новообразований [2, 15]. Тем не менее принято считать, что прогресс в теоретической области практически не отразился на состоянии дел в клинической онкологии. Содержание настоящего обзора призвано продемонстрировать несостоятельность подобных утверждений.

Действительно, если 70 и 80-е гг. XX века характеризовались прогрессом преимущественно в экспериментальной области, то символом последнего десятилетия стали именно практические достижения молекулярной онкологии. К настоящему моменту молекулярно-генетические подходы рутинно используются на всех этапах онкологической помощи, то есть в профилактике, диагностике, лечении и мониторинге пациентов. Наиболее заметные успехи отмечены в развитии лабораторных методов выявления групп онкологического риска, поиске диагностических и прогностических маркеров новообразований, разработке патогенетически обоснованных подходов к химиопрофилактике и химиотерапии неоплазм и, наконец, в генотерапии рака.

Молекулярно-генетические подходы к идентификации групп онкологического риска. Залогом успешного лечения новообразований является их своевременная диагностика. Существующие методы клинического скрининга обладают вполне достаточной эффективностью, однако по целому ряду причин их регулярное использование в полном масштабе (то есть на всей человеческой популяции) представляется весьма затруднительным. Концентрация диагностических мероприятий на так называемых группах онкологического риска признается разумным компромиссом, обеспечивающим сфокусированность превентивных усилий именно на тех индивидуумах, которые в них больше всего нуждаются. Поэтому разработка научно обоснованных подходов к формированию подобных групп представляется исключительно важной задачей.

Классическим примером онкологической предрасположенности является контакт с вредными факторами окружающей среды (курение, неправильное питание, производственные вредности и т.д.) [5]. Молекулярно-генетические исследования позволили выделить как минимум три “новые” категории факторов риска: хроническое носительство онкоспецифических вирусов, присутствие наследственных раковых мутаций и неблагоприятное сочетание аллелей некоторых полиморфных генов.

Вирусная теория рака длительное время доминировала среди остальных онкологических гипотез. Однако эксперименты конца 70-х гг. XX века убедительно доказали, Что вирусы не имеют никакого отношения к этиологии подавляющего большинства типов опухолей у человека. Тем не менее в последующие 20 лет был выявлен ряд исключений из этого правила. В частности, к настоящему моменту научно подтверждены ассоциации между папилломавирусами и раком шейки матки, вирусом Эпштейна-Барра и некоторыми видами лимфом и назофарингеальных карцином, вирусами гепатита и раком печени и т.д. [29]. Наибольшей практической значимостью обладают исследования последнего десятилетия, установившие причастность папилломавирусов (Human papilloma viruses -HPV) к возникновению рака гениталий [27].

HPV являются условно-патогенными вирусами, то есть в большинстве случаев их носительство протекает бессимптомно. Однако при неблагоприятном стечении пока неизвестных обстоятельств HPV инициируют процесс злокачественной трансформации. Папилломавирусы представляются основным этиологическим агентом рака шейки матки (РШМ) — наиболее частой опухоли репродуктивного тракта у женщин [27]. Встречаемость бессимптомной HPV-инфекции исключительно высока: наши собственные исследования показали, что около 30% здоровых посетительниц гинекологических консультаций заражены папилломавирусами [6]. Нужно оговориться, что онкологическую опасность представляет не носительство как таковое, а хронизация этого процесса, наблюдающаяся несколько реже — примерно у 5—10% женщин [23, 27]. В любом случае HPV-тестирование имеет чрезвычайную социальную значимость, так как позволяет выделить группы высокого риска РШМ. Известно, что для РШМ характерна строгая стадийность развития, причем возникновению злокачественной опухоли предшествует относительно длительный этап предракового поражения. Следовательно, выявление групп с онкологической предрасположенностью, которое позволяет направить клинические превентивные мероприятия на относительно небольшие группы пациенток, может существенно увеличить эффективность детекции опухолей шейки матки на ранних, дозлокачественных стадиях [24]. В заключение следует подчеркнуть, что наиболее достоверным методом диагностики HPV является молекулярно-генетический метод — полимеразная цепная реакция (ПЦР). HPV-тес
тирование доступно в отечественных условиях и рутинно применяется во многих современных гинекологических учреждениях [6].

Разрешение проблемы так называемого семейного рака представляется наиболее впечатляющим клинико-прикладным успехом молекулярной онкологии. Наследственные опухолевые синдромы составляют незначительную пропорцию от общего числа новообразований (около 1%), хотя для отдельных локализаций (молочная железа, толстая кишка) их удельный вес достаточно высок (5—8%). Причиной подобных заболеваний является носительство наследуемой “раковой” мутации. Лица, имеющие такое генетическое повреждение, до определенного момента остаются практически здоровыми, однако они обладают фатально увеличенным риском возникновения неоплазм — в 85—100% случаев. К настоящему моменту все основные типы семейного рака и соответствующие им мутации уже идентифицированы (табл. 1).

Следует заметить, что адекватная лабораторная диагностика на настоящий момент является чрезвычайно дорогостоящей, поэтому она остается труднодоступной даже в самых развитых странах. Зачастую врачу приходится ограничиваться лишь клиническими данными — множественными случаями заболеваний в семье, необычно ранним возрастом возникновения новообразования, присутствием первично-множественных неоплазм и т.д. Подозрение на носительство раковой мутации у здорового человека требует энергичных действий, направленных на профилактику и раннюю диагностику опухолей. В качестве наиболее демонстративного примера можно привести профилактические мастэктомии и овариэктомии, практикующиеся в отношении носителей повреждений в генах BRCA [3, 9, 20].

Таблица 1

Основные разновидности “наследственных опухолей” и генетически обусловленных опухолевых синдромов

Название заболевания	Основные виды опухолей	Ген	Хромосомна: локализация
Наследственный рак молочной железы	Карциномы молочной железы, часто билатеральные опухоли яичников	BRCA-1	17q
		BRCA-2	13q
Наследственный полипоз толстой кишки (Lynch синдром)	Множественные полипы толстой кишки, имеющие тенденцию к злокачественному перерождению	р53 (редко)  ATM (редко) АРС	17q 11q 5q
		MSH2	2p
Наследственный неполипо: ный рак толстой кишки	Множественные карциномы толстой кишки, часто в сочетании с опухолями других органов	MLH1	3p
		PMS1 (реже)	2p
Li-Fraumeni синдром	Саркомы, лейкозы, опухоли молочной	PMS2 (реже) р53	7p 17p
von Hippel-Lindau синдром	железы, мозга и других органов [ Двустороние неоплазмы почек; поражения	VHL	3p
Ретинобластома	головного мозга и других органов Билатеральное поражение сетчатки; саркомы	RB-1	13q
Множественная эндокринная неоплазия I типа	Поражение различных эндокринных желез	MEN-1	11q
Множественная эндокрин ная неоплазия II типа	(гипофиза, паращитовидных желез, поджелудочной железы и т.д.) Поражение щитовидной железы, зачастую	RET	10q
Gorin синдром	сопровождающееся опухолями других органов эндокринной системы Множественные базалиомы; реже — опухоли мозга	РТСН	9q
Опухоль Wilms	Билатеральное поражение почек	WT-1	11P
Нейрофиброматоз I типа (болезнь Recklinghausen)	Нейрофибросаркомы, глиомы,феохромоцитомы, лейкозы	NF1	17q
Нейрофиброматоз II типа	Менингиомы; двусторонние поражения слухового нерва	NF2	22q
Наследственная меланома	Множественные меланомы	INK4A, CDK4	9p, 12q

Примечание. Таблица заимствована [ 2].

Упомянутые выше наследственные мутации безусловно относятся к патологическим состояниям генома. Помимо них онкологическую предрасположенность могут модифицировать не только генетические повреждения, но и вариации в пределах нормы — аллельные полиморфизмы. В качестве наиболее наглядного примера можно привести исключительно высокую заболеваемость раком кожи среди европейских иммигрантов в Австралии. В данном случае белый цвет кожных покровов, являясь нормальным наследуемым полиморфным признаком и обеспечивая адекватную приспособленность в странах с низкой солнечной инсоляцией, оказывается онкологически неблагоприятным в австралийских условиях. По-видимому, особенности индивидуального генетического фона играют очень существенную, если не решающую роль в детерминации онкологического риска. Однако генетическая конституция человека складывается из тысяч взаимодействующих полиморфных аллелей, причем каждый полиморфизм по отдельности обладает лишь весьма умеренным эффектом. Поэтому роль нормальных вариаций генома в патологии с трудом поддается изучению, а результаты отдельных работ отличаются плохой воспроизводимостью. На сегодняшний день идентифицированы десятки полиморфных генов-кандидатов, которые могут принимать участие в формировании онкологического риска. К ним относятся представители семейств цитохромов, глютатион-трансфераз, ацетил-трансфераз, некоторые онкогены и антионкогены, участники гормонального метаболизма и т.д. (табл. 2). Наиболее достоверными наблюдениями можно считать ассоциацию “нулевого” генотипа GSTM1 с риском рака легких, а также взаимосвязь между длиной тринуклеотидного повтора рецептора андрогенов и риском рака простаты [10, 12, 21, 28].

Таблица 2

Полиморфные гены с предполагаемой ролью в детерминации онкологического риска

Ген	Локализация опухоли
HRAS-1	молочная железа
L-MYC	легкие (прогноз заболева­ния)
GSTM1, GSTT1, GSTP1	легкие, мочевой пузырь
CYP2D6, CYP1A1, CYP2E1	легкие, молочная железа
CYP17	молочная железа
CYP19	молочная железа
NAT1, NAT2	мочевой пузырь, толстая кишка, легкие
COMT	молочная железа
AR	предстательная железа
p53	молочная железа, шейка матки

Примечание: таблица составлена по данным работ [10, 12, 21, 28].

Диагностические и прогностические маркеры. В настоящее время молекулярная онкология предоставила врачам около 400 новых диагностических и прогностических показателей, которые используются или испытываются в клинической практике. Некоторые тесты уже получили обязательный статус. Исторически первым полигоном по внедрению молекулярно-генетических подходов стала клиника лейкозов. В частности, ПЦР-методы определения специфических транслокаций стали рутинно применяться уже в начале 90-х гг. XX века. Например, ПЦР-тест на транслокацию генов BCR-ABL примерно в 10 000 раз чувствительнее и значительно специфичнее гомологичного метода — кариотипического определения “филадельфийской хромосомы”. В этом же контексте уместно отметить, что ключевым толчком к привлечению молекулярной диагностики в онкогематологию явилось бурное развитие пересадок костного мозга. Действительно, для успешных трансплантаций потребовался целый комплекс лабораторных мероприятий: НLA-генотипирование, методы генетического мониторинга клеточных клонов, диагностика цитомегаловирусной инфекции и т.д. [1].

В клинике солидных опухолей наибольшую известность получили молекулярно-генетические тесты на амплификацию онкогенов NMYC и ERBB2. Увеличение числа копий онкогена NMYC зачастую наблюдается у больных нейробластомой и свидетельствует о плохом прогнозе заболевания. Неблагоприятные результаты подобного лабораторного исследования могут свидетельствовать о необходимости увеличения интенсивности терапевтических и диспансерных мероприятий. Амплификация гена ERBB2 при раке молочной железы имеет более широкое значение — она является не только прогностическим индикатором, но и указывает на специфический спектр чувствительности опухоли к химиопрепаратам. Более того, в настоящее время ведутся интенсивные клинические испытания специфических ингибиторов данного рецептора — разумеется, подобная терапия представляется оправданной только для ЕРВВ2-положительных неоплазм [2, 22].

С внедрением в патологоанатомическую практику методов иммуногистохимии, гибридизации in situ и проточной цитометрии ДНК в клинической онкоморфологии возникли принципиально новые условия для улучшения гистогенетической диагностики опухолей и выявления прогностических факторов. В настоящее время морфологическая диагностика дает возможность не только разработать основную схему лечения онкологического пациента, но и определить назначение конкретных химиотерапевтических препаратов. Так, например, при СО20-позитивных лимфомах, обнаруживаемых иммуногистохимически, показано применение мабтеры (ритуксимаба), то есть химерических моноклональных антител мыши/человека к упомянутому антигену; при этом наблюдается положительный терапевтический эффект со снижением токсичности при комбинированной химиотерапии [11].

Необходимо подчеркнуть, что во многих случаях морфологическое определение прогностических маркеров может быть более точным и информативным, чем при использовании биохимических и даже молекулярно-генетических методов, так как при этом виде исследования отчетливо обнаруживаются тканевые и клеточные структуры, экспрессирующие соответствующий фактор. Таким примером может служить выявление рецепторов эстрогена (РЭ) и прогестерона (РП) иммуногистохимическим способом. Определение экспрессии этих рецепторов является обязательным при гормональном лечении рака молочной железы (РМЖ). РЭ и РП имеют небольшое прогностическое значение, но очень важны для предсказания лечебного эффекта тамоксифена: при РЭ+ и РП+ непосредственные положительные результаты лечения достигаются у 70% больных РМЖ, а 5-летняя безрецидивная выживаемость доходит до 20—30 %. В случаях РЭ-и РП-добиться положительных результатов не удалось соответственно в 85% и 90% наблюдений [7].

Как упоминалось выше, одним из наиболее известных прогностических маркеров при РМЖ является онкоген ERBB2. Широкое распространение получил иммуногистохимический тест, направленный на выявление суперэкспресии соответствующего белка. Активация ERBB2 сопровождается неблагоприятным исходом заболевания, в то время как при нормальной экспрессии ERBB2 10-летняя выживаемость больных РМЖ без регионарных метастазов достигала почти 85%, повышение его уровня сопровождалось падением выживаемости до 40% [22]. Имеются свидетельства неблагоприятного прогноза при обнаружении избыточных количеств онкобелка ERBB2 для больных раком желудка, толстой кишки, шейки матки, предстательной железы и многими другими новообразованиями.

Мутация гена-супрессора р53, сопровождающаяся продукцией белка с длительным периодом полураспада, выявляется иммуногистохимически более чем в 50% РМЖ и может служить показателем плохого исхода заболевания и неэффективности адъювантной терапии [7]. Такие же результаты получены для рака желудка, толстой кишки, мочевого пузыря, предстательной железы, надпочечников и других неоплазм [8, 16].

Пролиферативная активность является ведущим фактором как в механизме злокачественной трансформации клеток, так и в биологическом поведении уже возникших опухолей. В настоящее время имеются высокоинформативные иммуногистохимические способы определения пролиферативной активности трансформированных клеток с помощью различных маркеров — 5-бром-2-дезоксиуридина, антигена Ki-67, ядерного антигена пролиферирующих клеток и т.д. С использованием перечисленных маркеров проведено большое количество исследований, посвященных изучению пролиферации самых разнообразных типов органов и тканей. Практически во всех из них сделаны одинаковые выводы: индекс пролиферации является независимым прогностическим признаком в отношении возникновения рецидива, развития метастазов, общей и безрецидивной выживаемости.

В самые последние годы в качестве прогностических признаков при опухолях началось активное изучение факторов, регулирующих прохождение клеток по митотическому циклу — циклинов и ингибиторов циклинзависимых киназ [18, 25].

На протяжении последней четверти уходящего века, главным образом благодаря исследовательской деятельности J. Folkman [13], создана стройная теория опухолевого ангиогенеза. Во многих экспериментах показаны динамика роста новообразований и их потенция к диссеминации в зависимости от степени развития снабжающих их кровеносных сосудов. Выделены в химически чистом виде факторы ангиогенеза опухолей и воспалительных инфильтратов, обладающих лимфогенным и хемотаксическим действием на эндотелий. Синтезированы ингибиторы ангиогенеза, действие которых через редукцию капиллярной сети опухоли приводит к регрессу последней. В течение последних 10 лет учение об ангиогенезе в опухолях нашло практическое применение в онкоморфологии. Имеющиеся сведения о степени развития кровеносных сосудов в резецированной злокачественной опухоли дают возможность определить риск возникновения рецидива, развития метастазов и исход онкологического заболевания. В таких исследованиях для оценки плотности сосудистой сети используются специфические иммуногистохимические маркеры эндотелия — VIII фактор свертываемости крови (фактор Виллебранда), антигены CD31 и CD34. Высокая прогностическая значимость выраженности ангиогенеза продемонстрирована для самых разнообразных новообразований [13]. В последнее время проведены иммуногистохимические исследования с выявлением факторов ангиогенеза — сосудистого эндотелиального фактора (тимидин-фосфорилазы), гепатоцитарного ростового фактора и т.д. Установлено, что высокая экспрессия этих факторов при колоректальном раке, раке желудка, гепатоцеллюлярной карциноме, аденокарциноме эндометрия и других новообразованиях сопровождается глубокой инвазией опухоли, развитием метастазов и неблагоприятным исходом заболевания [17].

Внимание патологоанатомов, стремящихся к поиску новых прогностических факторов в онкологии, было также привлечено к адгезивным молекулам (кадхеринам, катенинам, протеогликану CD44), регулирующим контакты раковых клеток между собой и с межклеточным матриксом, протеазам (металлопротеиназам и катепсинам), участвующим в процессах метастазирования, а также к мотогенам — цитокинам, регулирующим подвижность неопластических клеток. Изучение этих прогностических маркеров находится в самом начале своего развития, но уже получены очень интересные факты, и есть основания полагать, что отмеченное направление исследований будет перспективным [15].

Молекулярная онкология и новые походы к терапии опухолей. Идентификация молекулярных механизмов, принимающих участие в возникновении новообразований, позволила изменить характер подходов к поиску новых лечебных средств. Если раньше в этой области превалировал эмпирический подход, то за последние годы попытки терапевтической модификации биологически важных мишеней стали принимать целенаправленный, патогенетически обоснованный характер. Представляется уместным выделить 3 основные категории принципиально новых методологий в клинической онкологии: 1) химиопрофилактику; 2) молекулярно-обоснованную химио-и биотерапию; 3) генотерапию.

Под онкологической химиопрофилактикой понимается длительный прием нетоксичного лекарственного препарата, который существенно снижает риск возникновения злокачественной патологии (по стилю своего применения онко-химиопрофилактические средства похожи на фармацевтические формы витаминов). К настоящему моменту уже подведены первые итоги клинических испытаний антагониста эстрогенов — тамоксифена. Показано, что регулярное употребление последнего существенно снижает риск возникновения рака молочной железы. Недостатком тамоксифена является эпизодическое появление побочных эффектов. Сейчас проходят испытания более специфического антиэстрогенового препарата — ралоксифена. Предполагается, что применение ралоксифена не будет сопровождаться отрицательными последствиями. В отношении профилактики рака легкого большие надежды связывают с применением агонистов ретиноидных рецепторов. Интересными представляются эксперименты на животных, у которых удалось предотвратить возникновение опухолей толстой кишки посредством назначения ингибиторов циклооксигеназы [26].

Если до 90-х гг. XX века поиск антираковых химиопрепаратов базировался на феноменологических критериях, например, подбирались вещества, поражающие преимущественно быстро делящиеся клетки, то за прошедшее десятилетие появился принципиально новый алгоритм разработки терапевтических средств. В качестве мишени выбирается не свойство раковой клетки — по понятным причинам оно не может обладать высокой специфичностью, а биологическая молекула (чаще всего фермент), лежащая в основе злокачественной трансформации. Соответствующие фармацевтические препараты отличаются большей эффективностью и избирательностью действия, при этом их токсичность оказывается заметно ниже, чем у традиционных средств. Наилучшим примером служит специфическое ингибирование рецептора ERBB2, играющего ключевую роль в пролиферации клеток опухолей молочной железы. Для этой цели используют как биологические препараты (Herceptin -ERBB2-специфичные антитела), так и химические ингибиторы ЕРВВ2-тирозинкиназной функции [19, 22].

Большой интерес вызывают клинические испытания протоколов генотерапии рака. Наиболее логичными представляются попытки “исправить” повреждения онкогенов и антионкогенов в опухолевой клетке. Однако при реализации этой идеи возникают серьезные трудности, по крайней мере на сегодняшний день. Последние связаны не только с комплексной, множественной природой генетических повреждений в опухоли, но и с неспособностью существующих методов переноса генов поражать 100% клеток-мишеней. Тем не менее существует ряд остроумных подходов, которые могут иметь хорошие перспективы. В частности, интересной выглядит стратегия, направленная на перенос в клетки костного мозга гена множественной лекарственной устойчивости. Подобная процедура позволяет существенно повысить толерантность кроветворной системы к побочным эффектам химиотерапии и, следовательно, увеличить интенсивность последней. Другие подходы нацелены на трансфекцию клеток опухоли генами, активирующими биологически интактные формы цитостатических препаратов. Такие мероприятия обеспечивают локализованность антипролиферативного действия анти неопластических агентов. Опубликованы генотерапевтические протоколы, подразумевающие увеличение эффективности противоопухолевого иммунного ответа, например за счет переноса в клетки опухоли генов комплекса HLA [4, 14].

Таким образом, бурное развитие молекулярной генетики существенно видоизменило стиль клинической онкологии. Уже на сегодняшний день в большинстве современных онкологических лечебных учреждений представлен широкий арсенал средств, направленных на рутинное применение упомянутых в обзоре процедур. Очевидно, что внедрение молекулярных подходов в практику стало обязательным компонентом развития противораковой борьбы.

Работа выполнена при поддержке грантов подпрограммы “Национальные приоритеты в медицине и здравоохранении" (Проект 02 “Разработка новых методов диагностики и лечения больных злокачественными опухолями и гемобластозами" и Проект 05 “Генодиагностика и генотерапия социально-значимых заболеваний человека "), а также при частичном участии грантов IN CO-Copernicus IC 15-СТ97-0901 и РФФИ 99-04-48043.