Method for the determination of immune complexes by reaction with polyethylene glycol

Full Text

Роль иммунных комплексов в патогенезе различных заболеваний широко обсуждается в современной литературе. Показано, что циркулирующие иммунные.комплексы сопровождают бактериальные, вирусные, паразитарные, аутоиммунные процессы [3, 6]. В последнее время получил признание новый клинический термин «болезни иммунных комплексов», который отражает вероятность их участия в патологии человека [4].
Одним из наиболее простых методов определения циркулирующих иммунных комплексов является их осаждение из сывороток при помощи полиэтиленгликоля. Есть данные, что этот способ хорошо коррелирует с классическими методами выявления циркулирующих иммунных комплексов [2, 5].
Целью настоящего исследования явилось изучение этого метода при использовании отечественного оборудования, отработка условий реакции, а ' также выяснение возможности использования коммерческого гамма-глобулина (производства Казанского НИИЭМ) для оценки результатов реакции.
Мы пользовались методикой В. Гашкова и соавт. (1978) с некоторыми модификациями.
Необходимые для реакции растворы борной кислоты, буры и полиэтиленгликоля (м. в. 6 000, Австрия) готовили каждый раз свежие, так как их хранение сказыва- ется'на результатах реакции. Буферный раствор получали путём смешивания 55 мл 1,24% борной кислоты, 45 мл 1,9% буры и 100 мл дистиллированной воды. На этом буфере готовили 4,166% раствор полиэтиленгликоля.
Кровь от ’больного или здорового донора для получения сыворотки брали из вены в количестве 10,0 мл. В реакции использовали сыворотки свежие и со сроком хранения при +4°С не более 7 суток. Полученные сыворотки брали в объеме 0,4 мл и разводили в соотношении 1 : 2 буфером, на котором готовили раствор полиэтиленгликоля (0,4 мл сыворотки + 0,8 мл буфера). Разведенную сыворотку по 0,33 мл разливали в 2 пробирки: опытную и контрольную. Опытные пробирки содержали по 3,0 мл 4,166% раствора полиэтиленгликоля, а контрольные—по 3,0 мл буферного раствора. После розлива пробирки инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. По окончании инкубации пробы из опытной и контрольной пробирок замеряли на фотоэлектроколориметре ФЭК-60 при длине волны до 400 ммк. Определяли разницу в оптической плотности в опытной и контрольной пробах.
Результаты выражали в мкг/мл агрегированного человеческого гамма-глобулина, с помощью которого стандартизовали показатели реакции. Уровень циркулирующих иммунных комплексов рассчитывали по калибровочной кривой, построенной следующим образом. Брали три различные серии коммерческого гамма-глобулина (производства Казанского НИИЭМ), разводили его на физиологическом растворе в соотношении 1: 10 (1 мл гамма-глобулина + 9 мл физиологического раствора) и агрегировали на водяной бане при температуре 61°С в течение 40 мин. От каждой серии агрегированного гамма-глобулина (АГГ) пробы по 0,33 мл смешивали с 3,0 мл 4,166% раствора полиэтиленгликоля. Инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, затем центрифугировали при 5000 об./мин. Полученный осадок дважды отмывали смесью (0,33 мл физиологического раствора + 3,0 мл 4,166% раствора полиэтиленгликоля). К осадку добавляли 2 мл 0,1 н. раствора NaOH и определяли белок по Лоури. Таким образом устанавливали' содержание белка для каждой серии исходного АГГ, вступившего в реакцию с полиэтиленгликолем. Затем из каждой серии готовили на физиологическом растворе двукратные разведения (7г—74—7в—716—7зг) в объеме 1,0 мл и с каждым из них ставили реакцию. С помощью фотоэлектроколориметра замеряли разницу между опытной и контрольной пробами.
Зная количество белка-, вступившего в реакцию с полиэтиленгликолем, для исходного агрегированного препарата, вычисляли количество белка для каждого разведения и строили калибровочную кривую (см. рис.) По всем трем сериям были получены совпадающие результаты.
С целью установления нормальных показателей циркулирующих иммунных комплексов мы изучили сыворотки от 115 здоровых доноров (контрольная группа). Наряду с этим исследовали сыворотки 63 больных ревматоидным артритом и 16 больных системной красной волчанкой, в патогенезе которых участие иммунных комплексов доказано [1, 7].
Для сопоставления было проведено также исследование циркулирующих иммунных комплексов при ревматизме (46 больных) и хроническом тонзиллите с тонзиллогенным поражением миокарда (15 больных), при которых возможно присоединение иммуннокомплексной патологии к основному патологическому процессу по ходу болезни.
Показатели определения циркулирующих иммунных комплексов у здоровых допоров соответствовали реакции с АГГ в концентрации 80 — 200 мкг/мл. Лишь у 2 здоровых доноров показатели превышали 200 мкг/мл. Эта величина была принята нами за верхнюю границу нормы. Более высокие показатели у здоровых людей встречаются чрезвычайно редко и их ьРожно объяснить присутствием циркулирующих иммунных Комплексов у определенного процента практически здоровых лиц [2].
Циркулирующие иммунные комплексы удалось выявить у 60% больных ревматоидным артритом (РА), что значительно превышает частоту нахождения ревматоидного фактора, которая составила 25%. Уровень циркулирующих иммунных комплексов у больных этой группы соответствовал 907 ± 232 мкг/мл АГГ.
Мы не смогли установить корреляции между уровнем циркулирующих иммунных комплексов и степенью активности РА, однако обнаружили четкую зависимость между их наличием и выраженностью висцеральных поражений. Так' из 20 больных РА с развитием ревматоидного легкого и поражением почек при наличии положительных антинуклеарных реакций в титре 1 : 50 — 1 : 100 циркулирующие иммунные комплексы были найдены у 18, то есть у 80%, между тем как из 43 больных РА без выраженных висцеральных поражений — только у 20, что составило всего 44%.
Нами не выявлено положительное влияние изолированной глюкокортикоидной терапии на уровень циркулирующих иммунных комплексов при РА в ближайшие сроки (1 — 2 мес) после лечения в стационаре. Однако у 2 больных, обследованных нами после комплексной базисной терапии в период стойкой клинической ремиссии, он не превышал 300 мкг/мл.
У больных системной красной волчанкой, обследованных в активную Фазу болезни, циркулирующие иммунные комплексы были обнаружены в 87,5%. Их уровень соответствовал 835 ± 156 мкг/мл АГГ. Циркулирующие иммунные комплексы не были выявлены у 2 больных системной красной волчанкой в активной фазе болезни при наличии тяжелого волчаночного нефрита, что связано, возможно, с фиксацией иммунных комплексов на базальной мембране почечных клубочков.
У больных волчанкой, обследованных в период клинической ремиссии при отсутствии ЛЕ-клеток, снижении титра, антинуклеарных реакций ниже 1 : 200 и исчезновении периферического типа свечения, ядер при иммунофлюоресцентном исследовании, уровень циркулирующих иммунных комплексов не превышал 220—350 мкг/мл АГГ.
В группе больных ревматизмом циркулирующие иммунные комплексы были выявлены у 10 (21,7%) из 4’6 обследованных, причем уровень их оказался значительно ниже, чем у больных РА и системной красной волчанкой, соответствуя 401,4 ± ± 81,3 мкг/мл АГГ.
Корреляции между показателями активности ревматического процесса и наличием в сыворотке циркулирующих иммунных комплексов не было констатировано.
Следует подчеркнуть, что в группе больных хроническим тонзиллитом с тонзиллогенным поражением сердечной мышцы мы ни в одном случае не обнаружили повышения уровня циркулирующих иммунных комплексов, который в этой группе соответствовал 220 ± 35 мкг/мл АГГ.
Очевидно, наличие циркулирующих иммунных комплексов у больных ревматизмом при активном тонзиллите связано не столько с персистированием стрептококкового антигена, сколько с обусловленным поломкой отдельных звеньев иммунной системы нарушением элиминации иммунных комплексов из организма. Вопрос этот требует дальнейшего изучения.
ВЫВОДЫ.
1.Способ определения циркулирующих иммунных комплексов с помощью полиэтиленгликоля является простым и доступным для любой клинической лаборатории, где имеется фотоэлектроколориметр. Внедрение этого метода* в широкую клиническую, практику позволит расширить диагностические возможности клинических, лабораторий при обследовании больных с иммунопатологическими процессами.
2.Определение циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке больных коллагеновыми заболеваниями является ценным дополнительным лабораторным тестом, позволяющим врачу следить за. динамикой иммунопатологического процесса, его регрессией или генерализацией.

Калибровочная кривая для определения циркулирующих иммунных комплексов. По оси ординат — показатель экстинции в единицах оптической плотности; по оси абсцисс — агрегированный гамма-глобулин (в мкг/мл).

About the authors

B. A. Molotilov

Department of Bacterial Allergy, Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan, Russia

A. N. Mayansky

Department of Bacterial Allergy, Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan, Russia

N. D. Pozdnyak

Department of Bacterial Allergy, Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan, Russia

L. Ch. Samerkhanova

Department of Bacterial Allergy, Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan, Russia

References

Supplementary files