Study of biochemical markers in newborns with necrotizing enterocolitis

Full Text

Некротический энтероколит (НЭК) — одно из наиболее тяжёлых заболеваний у новорождённых, при котором органом-мишенью становится кишечник. По данным зарубежных авторов, НЭК встречается с частотой 2,4 на 1000 новорождённых, что составляет 2,1% всех детей, поступающих в неонатологические отделения интенсивной терапии; по сообщениям отечественных авторов — с частотой 4%. Как правило, болезнь развивается в первые 2 нед жизни, однако у 16% пациентов сразу после рождения. На практике детские хирурги чаще встречаются с энтероколитом уже на стадии перитонита, когда прогноз для жизни больных ухудшается, а летальность достигает 70%, при обширных некрозах кишечника — 100%. До последнего времени считали, что НЭК — удел «выживших недоношенных», однако на сегодня этот процесс часто диагностируют и у доношенных [1–6].

Недоношенность в сочетании с незрелостью иммунного ответа и гастроинтестинальных функций, а также перинатальные инфекции — главные факторы риска такого тяжёлого заболевания, как НЭК [4, 7, 8]. Учитывая мультифакториальный генез НЭК, в последнее время всё больше внимания уделяют вопросам ранней диагностики и прогнозирования исходов НЭК. В диагностике и прогнозировании НЭК используют ряд определённых биомаркёров. В настоящее время считают, что среди биохимических маркёров наиболее целесообразен анализ матриксных металлопротеиназ (ММП), кателицидина, трансферрина и фекального кальпротектина. Среди большой группы прогностических маркёров особое место занимает система ММП. Это группа цинк-зависимых нейтральных эндопептидаз, коллективно способных к деградации всех компонентов внеклеточного матрикса.

Из-за широкого спектра специфичности их субстрата матриксные металлопорфирины способствуют гомеостазу многих тканей и принимают участие в некоторых физиологических процессах, таких как реконструкция костей, развитие кровеносных сосудов, иммунитет и заживление ран [9].

На сегодняшний день открыто более 24 видов ММП. Эти протеазы выделяются как латентные ферменты различных типов клеток, включая нейтрофилы, тромбоциты, клетки мезенхимы, Т-клетки, моноциты, макрофаги и некоторые типы клеток опухолей. ММП в физиологических условиях секретируются из клеток в очень незначительном количестве. К примеру, ММП-9 секретируется нейтрофилами только в процессе деструкции повреждённых тканей.

ММП-2 и ММП-9 участвуют в реконструкции внеклеточного матрикса в тканях, гидролизуют основные структурные белки экстрацеллюлярного матрикса участвуют в деградации коллагена IV типа, служащего основным компонентом базальной мембраны, разрушение которой может способствовать развитию перфораций желудочно-кишечного тракта.

ММП-17, также известная как мембранный тип ММП-4, — фермент, играющий важную роль при различных онкологических заболеваниях и относительно мало изученный при заболеваниях кишечника [10, 11].

Кальпротектин принадлежит к группе кальций-зависимых белков и состоит из одной лёгкой и двух тяжёлых полипептидных цепей с общей молекулярной массой 36,5 кДа. Этот белок высвобождается из нейтрофилов и макрофагов при их активации или гибели. Его уровень в крови, синовиальной жидкости, моче и кале отражает активность воспаления и распространённость поражения. В кале пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника концентрация кальпротектина значительно возрастает и может быть в несколько раз больше, чем в плазме крови. Также выявлена связь между концентрацией кальпротектина в кале и миграцией нейтрофилов, что подтверждает прямую зависимость его уровня от активности воспалительного процесса в толстой кишке — результата усиленной миграции нейтрофилов через воспалённую слизистую оболочку кишечника [12].

Кателицидины — группа пептидов, выявленных в лимфоцитах и моноцитах, а также в эпителиальных клетках. Человеческий катионный антимикробный белок (hCAP18) остаётся к настоящему времени единственным идентифицированным человеческим кателицидином. Показано, что антибактериальный С-концевой фрагмент hCAP18 — LL37, проявляет антимикробную активность как против грамотрицательных, так и против грамположительных бактерий, грибов, вирусов и простейших. Этот пептид служит важным фактором реэпителизации ран, также была показана его ангиогенная активность in vivo и in vitro. Более того, LL37 функционирует в качестве хемотаксического агента для нейтрофилов, моноцитов и Т-клеток [13].

Изучение биохимических маркёров при НЭК позволит объяснить патофизиологию воспалительного ответа, разработать новые подходы к диагностике ранних стадий НЭК и определить эффективные способы прогнозирования исходов заболевания.

Цель исследования — изучение уровня биохимических маркёров для оптимизации диагностики и прогнозирования НЭК у новорождённых.

Исследования проведены в Научно-исследовательском институте педиатрии им. К.Я. Фараджевой (Баку, Азербайджан) в период с 2016 по 2018 гг. Под наблюдением находились 110 новорождённых с НЭК, поступивших в отделение реанимации и интенсивной терапии в возрасте от 1 до 28 дней.

Согласно стадиям НЭК, все обследованные новорождённые были разделены на три группы. Первую группу составили новорождённые с НЭК I стадии, вторую группу — новорождённые с НЭК II стадии, третью группу — новорождённые с НЭК III стадии. На основании клинико-рентгенологических признаков I стадия НЭК отмечена у 49 (40,5%), II стадия — у 48 (39,7%), III стадия — у 13 (10,7%) новорождённых. В контрольную группу вошли 30 условно здоровых недоношенных новорождённых в возрасте 0–7 дней без признаков инфекции. Мальчики составили 56,4% (62 младенца), девочки — 43,6% (48 детей).

При поступлении в стационар общее состояние было тяжёлым у 12 (10,9±3%) новорождённых, очень тяжёлое — у 88 (80±3,8%), преагональное — у 10 (9,1±2,7%) новорождённых. Анализ антропометрических показателей наблюдаемых новорождённых показал, что масса тела варьировала от 650 до 2500 г (2336,3±79,2 г), рост — от 33 до 48 см (45,3±1,0 см), окружность головы — от 27 до 34 см (32,7±0,9 см), окружность груди — от 26 до 32 см (32,1±0,9 см). Гестационный возраст был от 22 до 37 нед (35,3±0,3 нед). Срок гестации у 3 (2,7±1,6%) недоношенных составил 22–28 нед, у 13 (11,8±3,1%) недоношенных — 29–31 нед, у 25 (22,7±4,0%) — 32–34 нед, свыше 35 нед — у 69 (62,7±4,8%) новорождённых с задержкой внутриутробного развития, не соответствующих сроку гестации.

Диагноз был поставлен на основании клинического осмотра, параклинических и инструментальных методов исследования. Стадию заболевания определяли по клиническим проявлениям согласно классификации Walsh и Kliegman.

Всем детям проводили комплекс лабораторно-инструментальных методов исследования в соответствии с общепринятыми стандартами: общие анализы крови и мочи, биохимические анализы крови, определение кислотно-основного состояния, газового состава крови, посев крови и кала, иммунологические, молекулярно-биологические методы исследования [6].

Для рентгенологического исследования использовали стационарную рентгеновскую установку Ecoray HF 525 plus и передвижной рентгеновский аппарат Toshiba Portable X-ray Unit. Трансабдоминальное ультразвуковое исследование брюшной полости с допплерометрией проводили на аппарате Alokaprosound SSD 3500 SV с мультичастотным линейным датчиком 7,5 Гц, конвексным датчиком 5 Гц.

Большинство детей (78) находились на искусственном (66) и смешанном (12) вскармливании. Анализ особенности вскармливания детей до установления диагноза НЭК показал, что значительная часть младенцев (60±4,7%) находились на искусственном вскармливании, остальные — на грудном (24,5±4,1%) и смешанном (10,4±3,0%) вскармливании. В нашем исследовании высокая доля новорождённых, находящихся на искусственном вскармливании, по-видимому, является одним из основных факторов развития НЭК.

У 40 детей был определён уровень ММП-2, -9 и -17, кателицидина, трансферрина и фекального кальпротектина. Концентрации этих маркёров определяли в сыворотке крови новорождённых с НЭК при поступлении в реанимационное отделение и в динамике через 7 дней после лечения.

Для определения маркёров применяли иммуноферментный анализ с набором реактивов фирмы CUSABIO BIOTECH на анализаторе ElisysUnoHuman (Германия).

Полученные цифровые данные подвергли статистической обработке методами медицинской статистики. Применены методы вариационного (U-критерий Манна–Уитни, KU-критерий Краскела–Уоллиса), дисперсионного (ANOVA — F-Фишер, FS-Фишер–Снедекор), дискриминантного (чувствительность и специфичность) и ROC-анализов. Вычисления проводили в электронных таблицах Excel-2013 и SPSS-20.

Для установления факторов риска НЭК у наблюдаемых новорождённых был проведён ретроспективный анализ соматического и акушерско-гинекологического анамнеза 110 матерей. У 88 матерей новорождённых возраст был до 30 лет, а у 22 женщин — старше 30 лет. В исследовании превалировали матери в возрасте до 30 лет (р=0,019).

У матерей всех младенцев отмечен отягощённый акушерский анамнез (хроническая плацентарная недостаточность, анемия, гестоз первой и второй половины беременности, осложнения во время родов). У 93 (84,5±3,4%) женщин был гестоз первой половины беременности: в первой группе он отмечен в 39 (79,6±5,8%), во второй группе — в 43 (89,6±4,4%), в третьей группе — в 11 (84,6±10%) случаях. Во второй половине беременности гестоз зарегистрирован у 35 (31,8±4,4%) матерей, чаще встречаясь у матерей первой (38,8±7%) и второй (31,3±6,7%) групп по сравнению с женщинами третьей группы. Угроза выкидыша выявлена в 19 (17,3±3,6%) случаях.

Важно отметить, что у большинства женщин (63,6±4,6%) во всех группах данная беременность протекала на фоне анемии: у 63,3±6,9% женщин первой группы, 70,8±6,6% второй группы и 38,5±13,5% третьей группы.

Среди матерей обследованных новорождённых оперативное родоразрешение с помощью кесарева сечения зафиксировано в 51,8±4,8% случаев, у остальных 53 (48,2±4,8%) женщин были физиологические роды. Как видно из приведённых данных, половине пациенток было проведено кесарево сечение. У матерей новорождённых первой (55,1±7,1%) и третьей (53,8±13,8%) групп частота оперативного родоразрешения была выше, чем во второй группе (47,9±7,2%), но различия не имеют статистической значимости.

У новорождённых с перинатальными инфекциями присутствовали неустойчивая температура тела (75%), вялость (87,5%), вздутие и гиперестезия живота (87,5%), рвота (жёлчь, кровь), непроходимость кишечника (ослабление или исчезновение кишечных шумов), эритема или отёк брюшной стенки, постоянная локализованная масса в животе, асцит, кровянистый стул. Патогномоничными симптомами НЭК были утолщение кишечной, стенки, нарушение перистальтики кишечника, пневматоз и наличие свободной жидкости в брюшной полости.

У новорождённых с НЭК зафиксированы сопутствующие заболевания, способствующие более тяжёлому течению основного заболевания. Среди них наиболее часто встречались гипоксически-ишемическая энцефалопатия (82,7±3,6%), внутриутробные инфекции (60,9±4,7%), пневмонии (28,2±4,3%), сепсис (18,2±3,7%).

У 40 новорождённых с НЭК определены биохимические маркёры. Контрольную группу составили 10 условно здоровых недоношенных в возрасте 0–7 дней. У всех новорождённых с НЭК при поступлении обнаружены разные по степени выраженности изменения содержания ММП-2, -9 и -17, кателицидина, трансферрина в сыворотке крови и фекального кальпротектина в кале в зависимости от стадии заболевания по сравнению с контрольными значениями (табл. 1).

 

Таблица 1. Концентрация биохимических маркёров у новорождённых с некротическим энтероколитом на ­различных стадиях

Маркёры	Контрольная группа (n=10)	Первая группа (n=16)	Вторая группа (n=16)	Третья группа (n=8)	p (КУ)	p (F)
ММП-2, нг/мл	44,8±1,8 (35–52)	309,4±15,4 (249–519)*,**	374,1±23,4 (270–598)***,#	480,8±87,8 (285–950)*** ,#	0,040	F=4,686, p=0,015
ММП-9, нг/мл	122,1±2,7 (102–131)	367±20,5 (233–502)***	412,3±19,7 (284–522)***	544,1±25,4 (484–671)***,###,^^	0,001	F=13,617, p <0,001
ММП-17, нг/мл	397,2±23,1 (317–580)	983,6±75,7 (521–1444)***	1016,1±74,3 (533–1497)***	1426,6±142,5 (749–1989)*** ,### ,^^	0,035	F=5,666, p=0,007
Кателицидин, нг/мл	14,6±0,5 (12,7–16,9)	40,3±1,0 (33,5–47,8)***	43,8±1,5 (37,1–55,4)***	50,9±2,4 (41,3–61)***,#,^^	0,003	F=9,789, p <0,001
Трансферрин, нмоль/л	1,28±0,041 (1,05–1,45)	0,317±0,11 (0,04–1,08)***	0,137±0,063 (0,04–1,07)***	0,063±0,005 (0,04–0,09)***	0,093	F=2,092, p=0,138
Фекальный кальпротектин, мг/г	29±1,6 (21,9–38,6)	362,7±20,0 (242–480)***	580,5±25,0 (421–719)***,###	746,9±96,9 (331–1307)***,###,^	<0,001	F=20,739, p <0,001

Примечание. В скобках указан 95% доверительный интервал (нижняя и верхняя граница). Результаты непараметрического критерия Манна–Уитни: статистическая значимая разница: с контрольной группой *p <0,05, **p <0,01; ***p <0,001; с первой группой #p1 <0,05, ##p1 <0,01, ###p1 <0,001; с второй группой ^p2 <0,05, ^^p2 <0,01, ^^^p2 <0,001; p (КУ) — результаты одностороннего вариационного анализа по критерию Краскела–Уоллиса (сравнение трёх групп); p (F) — результаты однофакторного дисперсионного анализа по критерию Фишера (сравнение трёх групп); ММП — матриксная металлопротеиназа.

 

В результате проведения сравнительного анализа было установлено, что уровень ММП-2 у новорождённых в первой ­группе увеличи­вался
в 6,9 раза, во второй группе — в 8,3 раза, в третьей группе — в 10,7 раза (p=0,015; F=4,686). Аналогичным образом уровень ММП-9 повышался в 3 раза в первой группе, в 3,4 раза во второй группе, в 4,5 раза в третьей группе по сравнению с новорождёнными контрольной группы (p <0,001; F=13,617). Концентрация ММП-17 у новорождённых в первой и второй группах была почти одинакова, повышена в среднем 2,5 раза, a в третьей группе — в 3,6 раза по сравнению с контролем (p=0,007; F=5,666; см. табл. 1). По-видимому, установленные значимые изменения уровня ММП свидетельствуют о развитии осложнённого воспалительного процесса и избыточной активации нейтрофилов и эластаз, приводящей к деструкции тканей, что позволяет определить степень повреждения кишечника при НЭК у новорождённых.

Изменения показателей ММП-2 отмечено у новорождённых второй и третьей групп по сравнению с первой группой (p1 <0,001). У новорождённых с НЭК III стадии средние значения ММП-9 и -17 с различной степенью достоверности превышали показатели новорождённых c I и II стадиями НЭК (p1 <0,001; p2<0,01).

При определении уровня кателицидина в сыворотке крови у новорождённых с НЭК отмечено достоверное повышение его по сравнению с новорождёнными контрольной группы. Так, уровень кателицидина в первой группе составил 40,3±1,0 нг/мл, во второй группе — 43,8±1,5 нг/мл, третьей группе — 50,9±2,4 нг/мл, что в 2,8; 3 и 3,5 раза выше показателей в контроле соответственно (p <0,001).

Ещё одним маркёром диагностики НЭК в данной исследуемой группе служило исследование уровня трансферрина. Среднее значение содержания трансферрина в первой группе было 0,317±0,110 нмоль/л, во второй группе — 0,137±0,063 нмоль/л, в третьей группе — 0,063±0,005 нмоль/л. Так, у новорождённых с НЭК отмечена тенденция к снижению уровня в 4; 9,4 и 20,3 раза по сравнению с нормативными показателями. Наиболее низкий уровень трансферрина зарегистрирован у новорождённых с НЭК III стадии, что свидетельствует о более тяжёлом течении заболевания и возможности использования его как предиктора для изменения лечебной тактики.

Как видно из табл. 1, содержание в кале фекального кальпротектина у новорождённых первой группы составило 362,7±20,0 мг/г, что превышало контроль в 12,5 раза (p <0,001). Аналогичным образом изменялся уровень фекального кальпротектина у новорождённых второй и третьей групп, что значительно выше (в 20 и 25,8 раза; p <0,001) по сравнению с показателями контрольной группы.

Для оценки взаимосвязи исследуемых маркёров с НЭК была проведена оценка этих показателей с помощью ROC-анализа. 40 новорождённых с НЭК, у которых ­определяли биохимические маркёры, были разделены на две группы: выздоровевшие и умершие. С учётом малого интервала вариационного ряда изучаемых маркёров и на основе значений чувствительности и специфичности построена характеристическая ROC-кривая (receiveroperating characteristic). Вычислены площадь ROC-кривой, стандартная ошибка, определены 95% верхние и нижние границы площади и асимптотические значения (достоверность результата).

Согласно ROC-анализу, площадь для маркёра ММП-17 составила S=0,863±0,66 [95% доверительный интервал (ДИ) 0,734–0,992; р=0,005], для ММП-9 — S=0,716±1,22 (95% ДИ 0,477–0,954; р=0,096), для ММП-2 — S=0,610±0,153 (95% ДИ 0,310–0,911; р=0,0394), для кателицидина S=0,794±0,086 (95% ДИ 0,625–0,963; р=0,023), для трансферрина — S=0,301±0,106 (95% ДИ 0,094±0,509; р=0,125), для фекального кальпротектина — S=0,694±0,120 (95% ДИ 0,459±0,929; р=0,135), что свидетельствует об их хорошей прогностической значимости.

Далее были определены «cut of point» для каждого маркёра. Оптимальной «точкой отсечения» для ММП-17 является величина 1350 пг/мл. В этой точке чувствительность (Se) равна 83,3±15,2%, специфичность (Sp) — 88,2±5,5%; для ММП-9 ≥510 пг/мл — Se 50,0±20,4%, Sp 91,2±4,9%; для ММП-2 ≥470 пг/мл Sе 50,0±20,4%, Sp 91,2±4,9%; для кателицидина ≥41,2 пг/мл Se 100,0±0,0%, Sp 52,9±8,6%; для трансферрина ≤0,065 нг/мл Se 66,7,4±19,3%, Sp 70,6±7,8%, для фекального кальпротектина ≥625 мг/г Se 66,7±19,2%, Sp 76,5±7,3%. Согласно исследованиям, установленный общий диагностический вес теста для ММП составил 17–87,5%, ММП-9 — 85%, ММП-2 — 85%, что позволяет использовать ММП в качестве маркёров для диагностики и прогноза исходов НЭК.

С помощью дисперсионного анализа ANOVA (FS — критерий Фишера–Снедекора) мы оценили степень влияния каждого фактора на исход в прогнозировании состояния новорождённых с НЭК (табл. 2).

 

Таблица 2. Прогностическая значимость факторов в отношении исхода некротического энтероколита у новорождённых

Маркёры	Критерий	СФВ	95% ДИ, нижняя граница	95% ДИ, верхняя граница	FS	p
ММП-17, нг/мл	>1350	59,9	55,5	64,2	56,7	0,000
ММП-9, нг/мл	>510	20,4	11,8	29,0	9,7	0,001
ММП-2, нг/мл	>470	20,4	11,8	29,0	9,7	0,001
Кателицидин, нг/мл	>41,2	13,3	4,4	22,1	6,1	0,009
Трансферрин, нмоль/л	<0,065	8,4	0,0	18,3	3,5	0,038
Фекальный кальпротектин, мг/г	>625	12,7	3,3	22,1	5,5	0,012

Примечание: СФВ — степень влияния фактора; ДИ — доверительный интервал; FS — значение критерия Фишера–Снедекора (Fisher–Snedecor); ММП — матриксная металлопротеиназа.

 

Как видно из табл. 2, наиболее значимое влияние на исход заболевания выявлено при повышенной концентрации ММП-17 — степень влияния фактора (СФВ) = 59,9 (95% ДИ 64,2–55,5; р <0,001), ММП-9 — СФВ=20,4 (95% ДИ 29,0–11,8; р <0,001), ММП-2 — СФВ=20,4 (95% ДИ 29,0–11,8; р <0,001), что также связано с развитием эндотоксинемии. Проведённые исследования позволяют считать, что изменение концентрации ММП свидетельствуют о манифестации септического процесса, осложнённого некротическим повреждением кишечника, с высокой вероятностью неблагоприятного исхода.

По данным исследования, учитывая общий диагностический вес теста фекального кальпротектина (75%), его можно использовать как неинвазивный маркёр воспаления в кишечнике.

Обнаруженные изменения уровня биохимических маркёров служат предикторами ранних стадий НЭК, начала острого воспалительного процесса в кишечнике, тяжести и продолжительности патологического процесса. У новорождённых с НЭК на фоне активного комплекса лечения повышение уровня этих маркёров свидетельствует о неблагоприятном течении и прогрессировании заболевания в третью стадию с высоким риском перфорации кишечника, что требует адекватного хирургического вмешательства.

Вывод

Исследование уровня матриксных металлопротеиназ, кателицидина, трансферрина в крови и фекального кальпротектина в кале показывает возможность использования этих биохимических маркёров в диагностике, ­прогнозировании исходов и оптимизации лечения некротического энтероколита в неонатальной практике.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

About the authors

S A Mekhtieva

Scientific Research Institute of Pediatrics n.a. K. Faradzhova

Author for correspondence.
Email: nauchnayastatya@yandex.ru
Baku, Azerbaijan

S R Nasirova

Scientific Research Institute of Pediatrics n.a. K. Faradzhova

Email: nauchnayastatya@yandex.ru
Baku, Azerbaijan

N Dzh Rakhimova

Scientific Research Institute of Pediatrics n.a. K. Faradzhova

Email: nauchnayastatya@yandex.ru
Baku, Azerbaijan

I A Gafarov

Azerbaijan Medical University

Email: nauchnayastatya@yandex.ru
Baku, Azerbaijan

References

Supplementary files