Dynamics of pertussis antibodies in saliva and serum of vaccinated donors

Full Text

Клиническая диагностика современного коклюша затруднена из-за широкого распространения легких и стертых форм этой инфекции [1, 4, 6]. Основным методом лабораторной диагностики заболевания является бактериологический анализ [9]. Однако он имеет много недостатков, главные из которых — низкая высеваемость возбудителя, связанная с поздними сроками обследования и нестандартностью различных серий коммерческой среды КУА производства Дагестанского НИИ питательных сред, а также длительность и трудоемкость исследования, обусловленные необходимостью проведения повторных анализов [3, 10].

Разработанные к настоящему времени методы серологической диагностики коклюша характеризуются различной чувствительностью и сложностью. Наиболее перспективными в этом отношении являются методы иммуноферментного анализа, не уступающие по чувствительности радиоиммунному методу, но менее дорогостоящие и трудоемкие.

Целью нашей работы было изучение возможности определения противококлюшных антител в слюне доноров-добровольцев, иммунизированных коклюшной моновакциной, по реакции агглютинации и непрямым методом иммуноферментного анализа с помощью твердофазного носителя.

В качестве антигена для постановки реакции агглютинации использовали коклюшный диагностикум — коммерческий препарат производства Института эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи. Непрямую иммуноферментную реакцию ставили, применяя диагностическую тест-систему для обнаружения антител к В. pertussis [7]. В качестве антигенов диагностическая тест-система содержала белковую протективную фракцию коклюшного микроба, липополисахаридную токсическую фракцию и суммарную фракцию антигенов микробной клетки — дезинтеграт, которыми были сенсибилизированы 96-луночные планшеты. Конъюгатом служили кроличьи иммуноглобулины против глобулинов человека, соединенные с пероксидазой хрена. В качестве субстратного раствора использовали смесь 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода. Учет реакции проводили с помощью фотометра при длине волны 450 нм.

Для выявления противококлюшных антител было проанализировано 169 образцов слюны и сыворотки крови доноров-добровольцев в возрасте от 20 до 50 лет, иммунизированных коклюшной моновакциной. Слюну собирали утром, натощак, без предварительной стимуляции, через 1,5—2 ч после чистки зубов, затем центрифугировали при 3000 об./мин в течение 20 мин. После этого отсасывали надосадочную жидкость и 5 мл этой жидкости замораживали в запаянных ампулах для исследования методом иммуноферментного анализа без дополнительной обработки. В оставшейся части определяли уровень противококлюшных антител по реакции агглютинации. Кровь для анализа получали из вены. Исследования проводили до первой иммунизации и через 15 дней после нее, затем после второй иммунизации спустя 15, 27, 34, 54 и 96 дней. Двукратное привитие производилось с интервалом 15 дней подкожно коклюшной моновакциной в дозах 15 и 20 млрд, микробных клеток. Статистическую оценку результатов проводили с помощью критерия знаков [2].

У всех доноров на всех сроках исследования как в сыворотке крови, так и в слюне обнаруживались противококлюшные антитела. Однократная иммунизация доноров коклюшной вакциной приводила к существенному накоплению антител в слюне (см. табл.). На 15-й день после иммунизации средние геометрические титры противококлюшных антител в слюне были в 8 раз выше исходных величин (Р<0,01). Повторное введение антигена на фоне высоких титров антител в слюне не вызывало дальнейшего подъема антител. Уровень их сохранялся до 15-го дня после второй иммунизации. Затем наблюдалось снижение титра антител до исходного уровня к 27-му дню после второй прививки (Р<С0,01) с последующим повышением к 34-му дню (Р<0,05), сохранявшееся до 54-го дня. На последующих сроках наблюдения эти титры снижались ниже исходных.

Однократная вакцинация коклюшной моновакциной доноров не приводила к достоверному повышению титра антител в сыворотке крови (2,0±1,4 и 4,0+1,6; Р>0,05). На 15-й день после повторного введения антигена титр коклюшных агглютининов возрос в 198 раз (Р<С0,01); на 27-й — несколько снизился. На последующих сроках наблюдения до 96-го дня титр антител в сыворотке крови сохранялся на том же уровне и был выше исходного (Р<С0,01). Сравнение титров антител в слюне и сыворотке крови показало, что после однократной вакцинации в слюне происходит более раннее и интенсивное накопление антител, чем в сыворотке крови (Р<С0,05). После повторной вакцинации титр антител в слюне был на всех сроках существенно ниже, чем в сыворотке крови, однако динамика накопления антител в слюне и сыворотке крови доноров в основном совпадала.

Динамика титров антител ко всем трем антигенам В. pertussis была различной. Наиболее высокие титры антител в слюне наблюдались при использовании в качестве антигена липополисахаридного (ЛПС) компонента микробной клетки. В отношении этого антигена некоторое повышение средних геометрических титров антител отмечалось уже после однократной иммунизации доноров (Р<С 0,01). После повторной вакцинации титры продолжали нарастать и через 15 дней достигали максимума (Р<0,01), затем содержание антител снижалось к 34-му дню после повторной вакцинации (Р<С0,05), однако оставалось выше исходного уровня (Р<0,01). На последующих сроках в содержании антител намечалась тенденция к нарастанию. К 96-му дню после повторной вакцинации титры антител вновь достигали максимума, достоверно превышающего исходный уровень.

В отношении белкового компонента микробной клетки после первичной иммунизации выявлялось снижение титров антител в слюне доноров (Р<0,05). К 54-му дню после повторной вакцинации титры антител в слюне снижались до исходного уровня (Р<0,05) и сохранялись такими до 96-го дня. Содержание антител в слюне доноров в отношении дезинтеграта микробной клетки после первичной вакцинации имело тенденцию к некоторому нарастанию (Р>0,05). После повторной иммунизации титры антител незначительно повышались с максимумом на 27-й день (Р>0,05) и к 34-му дню вновь уменьшались до исходного уровня, не изменяясь до 96-го дня.

При сравнении содержания антител в слюне доноров, определяемых по реакции агглютинации и методом иммуноферментного анализа с использованием различных антигенных фракций микробной клетки, наибольшее сходство установлено в динамике накопления агглютининов и антител к липополисахаридному антигену В. pertussis. Максимальные титры агглютининов, наблюдавшиеся после первой и второй иммунизации, были существенно выше титров антител, определяемых в слюне методом ИФА. На последующих сроках титры агглютининов в слюне снижались и не превышали уровня антител, выявляемых иммуноферментным методом.

Исследование содержания противококлюшных антител в сыворотке крови доноров методом иммуноферментного анализа показало, что динамика накопления антител к каждой из 3 антигенных фракций имела вид двугорбой кривой. Наиболее высокие титры обнаружены к белковому компоненту микробной клетки. Уже после первой иммунизации происходило интенсивное накопление антител, средний геометрический титр которых на 15-й день был существенно выше исходного (1259±2,0 и 5012±1,2; Р<С0,01). Повторная иммунизация, проведенная на фоне высоких титров антител, привела к уменьшению их содержания до 3981,0±1,2 (Р<0,05). В последующем отмечался новый подъем титров антител с максимумом на 34-й день после повторной иммунизации, затем вновь снижение, однако в течение всего срока наблюдения они были существенно выше исходных величин. Уровень накопления антител к липополисахаридному компоненту микробной клетки на всех сроках исследования до 54-го дня после повторной иммунизации был существенно ниже, чем к двум другим антигенным фракциям В. pertussis. Первичная иммунизация коклюшной моновакциной, проведенная на фоне высокого содержания антител к липополисахаридному компоненту микробной клетки, вызывала существенное снижение их уровня в крови (1259,0±1,4 и 1000,0±1,5; Р<С0,05). После повторной вакцинации их уровень начинал нарастать и превышал исходный к 15-му дню (1995,0+; 1,4; Р<0,01). Затем титры антител вновь падали ниже исходных, достигнув наименьшей величины на 34-й день (398,1+2,2; Р<0,05). В дальнейшем титры антител к липополисахаридной фракции нарастали (Р<0,05) и к концу наблюдения достигали исходных величин^

Динамика уровня антител к дезинтеграту микробной клетки, содержащему липополисахаридный и белковый компоненты, отражает особенности накопления антител к каждой из этих антигенных фракций. Максимальные титры антител к дезинтеграту, отмеченные на 15-й день после повторной вакцинации, не превышали на 34-й день наибольшего уровня антител к белковому компоненту (5012,0±1,3 и 6310,0±1,2; Р<0,01), и в то же время на всех сроках исследования они были достоверно выше титров антител к липополисахаридному антигену.

При сравнительном изучении антител, определяемых по реакции агглютинации и методом иммуноферментного анализа, в крови доноров было выявлено наибольшее сходство в динамике накопления агглютининов и антител к дезинтеграту коклюшного микроба. Метод иммуноферментного анализа оказался более чувствительным по сравнению с реакцией агглютинации. Сопоставление полученных данных с материалами других исследователей [5, 8] показало аналогичный характер динамики накопления антител в сыворотке крови, определяемых методом Л иммуноферментного анализа ко всем трем антигенным фракциям В. pertussis у привитых.

Таким образом, использование реакции агглютинации и метода иммуноферментного анализа для обнаружения коклюшных антител в слюне привитых доноров позволяет избегать венепункции.

About the authors

N. F. Amphitheatrova

Kurashov Kazan Order of the Red Banner of Labor Medical Institute; Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology; Mechnikov Central Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan; Kazan; Moscow

N. M. Bulatov

Kurashov Kazan Order of the Red Banner of Labor Medical Institute; Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology; Mechnikov Central Research Institute of Vaccines and Sera

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan; Kazan; Moscow

A. N. Savinova

Kurashov Kazan Order of the Red Banner of Labor Medical Institute; Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology; Mechnikov Central Research Institute of Vaccines and Sera

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan; Kazan; Moscow

N. Yu. Nizamova

Kurashov Kazan Order of the Red Banner of Labor Medical Institute; Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology; Mechnikov Central Research Institute of Vaccines and Sera

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan; Kazan; Moscow

Yu. V. Borisenko

Kurashov Kazan Order of the Red Banner of Labor Medical Institute; Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology; Mechnikov Central Research Institute of Vaccines and Sera

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan; Kazan; Moscow

References

Supplementary files