Analysis of oxidative modification of rat epididymal mitochondrial proteins under normobaric chronic hypoxia and modulation of nitric oxide (II) synthesis

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

Background. The molecular mechanism of NO effects in adaptation to hypoxia is of interest as a potential point of application in the therapy of fertility disorders.

Aim. To assess the degree of oxidative modification of epididymal mitochondrial proteins during hypoxia under conditions of experimentally modified NO synthesis.

Material and methods. Sexually mature rats were divided into four groups of 8 individuals: (1) control (animals without hypoxia); (2) chronic normobaric hypoxia, the animals were kept in a sealed chamber with oxygen reduced to 10% once a day for 14 days; (3) animals with hypoxia were injected with an inhibitor of the synthesis of nitric oxide (II) L-nitroarginine methyl ester at a dose of 25 mg/kg intraperitoneally once a day for 7 days; (4) animals with hypoxia were injected with the substrate for NO synthesis L-arginine at a dose of 500 mg/kg intraperitoneally once a day for 10 days. In the mitochondrial fraction of the head and tail of the epididymis, the activity of superoxide dismutase, the amount of NO metabolites, and the degree of oxidative modification of proteins were evaluated. Statistical analysis was performed using the Shapiro–Wilk, Mann–Whitney, and Spearman tests; differences were considered significant at p <0.05.

Results. Hypoxia led to an increase in the oxidative modification of proteins in the mitochondria of the head of the epididymis — 319.12 [240.98; 363.63] c.u./mg protein relative to control — 17.89 [15.31; 27.62] c.u./mg protein, p=0.0009. In the mitochondria of the tail of the epididymis, the oxidation of proteins under the studied conditions was less pronounced. The use of L-nitroarginine methyl ester, as well as L-arginine, led to a decrease in the level of oxidative modification of proteins in the head of the epididymis relative to the hypoxia model — 39.89 [29.25; 43.17] and 37.25 [34.91; 40.96] c.u./mg of protein, respectively, p=0.0009.

Conclusion. Mitochondrial proteins in the head of the epididymis are more susceptible to oxidative damage during hypoxia; a decrease in the level of NO metabolites under conditions of oxygen deficiency is associated with a decrease in the oxidative modification of mitochondrial proteins.

Full Text

Актуальность

Одна из проблем репродуктивного здоровья человека — бесплодие, вызванное нарушением способности сперматозоидов к оплодо­творению [1]. Причиной изменения качества и количества половых клеток может быть нарушение их транспортировки и хранения в эпидидимисе, где половые клетки приобретают способность к движению и проникновению в яйцеклетку. Одним из вероятных факторов, приводящих к подобным изменениям, называют гипоксию, развивающуюся вследствие нарушения кровообращения или частого пребывания в тесных, душных, плохо вентилируемых помещениях [2].

Образующиеся в большом количестве при гипоксии активные формы кислорода [3, 4] снижают подвижность сперматозоидов [5]. Однако каудальный отдел эпидидимиса более приспособлен противостоять патологическим процессам при депривации кислорода за счёт высокой, по сравнению с другими функциональными отделами придатка яичка, экспрессии фактора, индуцируемого гипоксией, [6] и супероксиддисмутазы [7]. Такие тканеспецифичные отличия обусловлены необходимостью поддержания инертности среды при хранении сперматозоидов. С другой стороны, собственная метаболическая активность эпидидимиса напрямую зависит от непрерывной доставки питательных веществ и кислорода [8].

Состояние хронической гипоксии сопровождается нарушением работы цепи переноса электронов, что неизбежно приводит к развитию окислительного стресса и вторичной митохондриальной дисфункции [9, 10]. Результатом нарушения работы митохондрий становится генерация избыточного количества активных форм кислорода, которые способны окислять функциональные группы аминокислот в составе белков с образованием карбонильных производных. Это может приводить к нарушению функций белков, их структурной организации и деградации [11, 12].

В связи с этим одним из важных показателей нарушения обменных процессов в тканях при окислительном стрессе называют окислительную модификацию белков [13]. Выделяют несколько типов карбонильных производных — альдегиды и кетоны, которые могут быть основного или нейтрального характера. Уровень карбонилированных белков в биоматериале способен отражать характер и степень повреждения белков [11].

Регуляция адаптации тканей к дефициту кислорода может осуществляться посредством оксида азота (II) [13], проявляющего как прооксидантные, так и антиоксидантные свойства в зависимости от концентрации. При длительном воздействии дефицита кислорода происходит повышение содержания NO в крови лабораторных животных [14]. Существуют данные о влиянии фактора, индуцируемого гипоксией, на повышение экспрессии нейрональной изоформы синтазы оксида азота [15], однако влияние NO на стабильность фактора, индуцируемого гипоксией, не доказано [14], что оставляет поле для исследования участия оксида азота (II) в адаптации к гипоксии.

Молекулярный механизм повреждающего действия NO и его роль при адаптации к дефициту кислорода активно рассматривают в современной исследовательской практике [16, 17]. Стимуляция синтеза NO введением естественного субстрата его синтеза L-аргинина способна улучшить состояние тканей за счёт увеличения микроциркуляции крови [18]. Блокируя работу гемсодержащих ферментов, таких как цитохромоксидаза [19], оксид азота (II) участвует в перераспределении O2 в клетке, направляя его в другие кислород-зависимые реакции [20]. Дефицит продукции оксида азота (II) может быть пусковым механизмом развития окислительного стресса из-за недостаточной эффективности его антиоксидантного действия, что способно привести к развитию вторичной митохондриальной дисфункции [21].

Механизм окислительного повреждения белков, опосредованного воздействием оксида азота (II), можно представить следующим образом: NO вызывает нитрозилирование остатков цистеина, тем самым изменяя функциональную активность белков [12]. Реакция эта обратима и может привести к образованию промежуточной формы — сульфеновой кислоты [22], которая является предшественником остальных изменённых форм аминокислот, регистрируемых как окислительные модификации белка. Однако не следует рассматривать этот процесс как сугубо патологический, поскольку нитрозилирование белков носит адаптационный характер [23]. К примеру, в исследованиях на мышах показано, что при ишемии уменьшение количества оксида азота (II) и его производных приводит к снижению содержания модифицированного цистеина в белках, но при этом происходит ухудшение состояния [24].

Таким образом, изучение молекулярных основ патогенеза при гипоксии не теряет актуальности. Важный элемент экспериментального подхода к этому вопросу — поиск целей для лекарственных препаратов, а также веществ, служащих эффективными антигипоксантами [25, 26].

Цель

Цель нашего исследования заключается в оценке степени окислительной модификации белков митохондрий клеток головки и хвоста придатка яичка при хронической нормобарической гипоксии в условиях экспериментально изменённого синтеза NO.

Материал и методы исследования

Эксперимент выполнен на 32 половозрелых самцах крыс сток Wistar с массой тела 200–280 г, которых содержали в стандартных условиях вивария на базе РязГМУ им. И.П. Павлова. Работа с животными одобрена на заседании комиссии по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных (протокол №16, от 06.12.2018) и осуществлялась в соответствии с «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986), приказом МЗ РФ от 1 апреля 2016 г. №199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» и приказом МЗ СССР от 12.08.1977 №755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных».

Животные были разделены на четыре группы, по 8 особей в каждой.

– Первая группа: контроль — животные, которые были помещены в вентилируемую камеру и не подвергались гипоксии.

– Вторая группа: животные, подвергшиеся воздействию хронической нормобарической гипоксии по методике острой нормобарической гипоксической гипоксии с гиперкапнией у мышей [27] в нашей модификации. Для моделирования хронической нормобарической гипоксии в условиях атмосферного давления без подъёма на высоту использовали герметичную камеру объёмом 1,2 л (10,5×10,5×11 см), которая была подключена к многоканальному газоанализатору МАГ-6-П-К (О2, интервал измерения 0–100%; СО2, интервал измерения 0–12%) так, что камера и газоанализатор составляли замкнутое пространство. Длительность нахождения животного в гермокамере определялась не временными рамками, а индивидуально для каждого животного по показателю газоанализатора, сеанс длился до тех пор, пока уровень кислорода в камере не снижался до 10% [28]. Таким образом, обеспечивалось единообразие условий по формированию гипоксии средней тяжести и подтверждалось, что все животные достигали критической отметки — 12% О2. В среднем крысы находились в камере по 14–18 мин. Манипуляции повторяли ежедневно 1 раз в день в утренние часы на протяжении 14 дней [29].

– Третья группа: хроническая нормобарическая гипоксия + метиловый эфир L-нитроаргинина (L-NAME) — животные, подвергшиеся гипоксии, которым в течение 7 дней (с 8-го по 14-й) вводили раствор L-NAME (ингибитора NO-синтазы) 1 раз в день ежедневно из расчёта 25 мг L-NAME на 1 кг массы тела животного [30].

– Четвёртая группа: хроническая нормобарическая гипоксия + L-аргинин — животные, подвергшиеся гипоксии, которым в течение 10 дней (с 5-го по 14-й) вводили раствор L-аргинина 1 раз в день из расчёта 500 мг L-аргинина на 1 кг массы тела животного [31].

Инъекции животным третьей и четвёртой групп проводили в утренние часы одноразовым инсулиновым шприцем внутрибрюшинно.

В последний день эксперимента сразу после окончания процедур крыс вводили в наркоз смесью тилетамина гидрохлорида, золазепама гидрохлорида и ксилазина гидрохлорида в дозе 6 мг/кг массы тела животного внутримышечно. Далее отбирали головку и хвост придатка яичка, из которых получали гомогенаты с помощью гомогенизатора Potter S (Sartorius AG, Германия) в Трис-HCl буфере, pH=7,4, содержащем 0,25 М раствор сахарозы, в соотношении 1 часть ткани к 9 частям буфера.

Все процедуры проводили при температуре не выше 4 °С. Полученные гомогенаты центрифугировали дважды: по 15 мин при 3000 g для осаждения ядер и неразрушенных клеток и при 14 000 g для осаждения митохондрий. Осадок ресуспендировали в среде выделения и использовали в качестве материала для исследования.

В каждой пробе определяли концентрацию общего белка по методу Лоури с помощью набора «КлиниТест-БЛ» (ЭКО Сервис, РФ, фотоколориметр КФК-3-01-ЗОМЗ, РФ).

Активность супероксиддисмутазы [в у.е./мг белка, где за 1 у.е. принимали величину (%) ингибирования скорости реакции аутоокисления кверцетина в присутствии материала за 1 мин] [32] определяли фотометрически (КФК-3-01-ЗОМЗ, РФ).

Количество метаболитов оксида азота (II) (в нмоль/мг белка) оценивали по интенсивности розовой окраски, образующейся в реакции азосочетания нафтилэтилендиамина с диазотированным сульфаниламидом (реактив Грисса), который образуется в присутствии нитритов; интенсивность окраски зависит от количества нитритов и нитратов, которые восстанавливаются в нитриты с помощью VCl3 [33]. Этот показатель определяли фотометрически в 96-луночном микропланшете на иммуноферментном анализаторе StatFax 3200 (Awareness Technology Inc., США).

Содержание продуктов спонтанной окислительной модификации белков (в у.е./мг белка) оценивали путём подсчёта площади под кривой спектра поглощения 2,4-динитрофенилгидразонов, образующихся в реакции карбонильных производных белков с 2,4-динитрофенилгидразином [11], спектр поглощения получали с помощью спектрофотометра СФ-2000 (ОКБ Спектр, Россия). Расчёты проводили с помощью программы для электронной вычислительной машины «Программа определения уровня карбонильных производных белков и резервно-адаптационного потенциала в норме и при патологии» [34].

Площадь под кривой спектра поглощения 2,4-ДНФГ-производных аминокислот можно разделить на трапеции, основаниями которых являются линии, отсекающие спектр в точке, соответствующей определённой длине волны. В зависимости от длин волн площадь трапеции будет отображать количество 2,4-ДНФГ альдегидных производных аминокислот нейтрального (230, 254, 270, 280, 356 нм) и основного (428 и 430 нм) характера, а также кетоновых производных нейтрального (363 и 370 нм) и основного (434, 520 и 535 нм) характера.

Параллельно определению спонтанной окислительной модификации белков проводили металл-зависимое окисление, служившее критерием оценки потенциально возможного максимального повреждения белковых молекул, принимаемое за 100%. Резервно-адаптационный потенциал рассчитывали, как разницу между показателями металл-зависимой и спонтанной окислительной модификации белков, выражали в процентах (%).

Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Microsoft Excel 2013 и StatSoft Statistica 12. Нормальность распределения определяли с помощью критерия Шапиро–Уилка. Для оценки уровня значимости в группах, где выборка данных подчинялась нормальному закону распределения, использовали параметрический t-критерий Стьюдента, если распределение не соответствовало нормальному хотя бы в одной из групп сравнения — непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Для выявления взаимосвязи между показателями применяли критерий ранговой корреляции Спирмена, тесноту взаимосвязи между показателями при наличии корреляции оценивали по шкале Чеддока. Уровень различий считали статистически значимым при вероятности ошибки p <0,05. При значении 0,05 ≤р <0,10 считали вероятной тенденцию к изменению показателей.

Результаты

Количество метаболитов оксида азота (II) достоверно снижалось в условиях хронической нормобарической гипоксии по сравнению с группой контроля в каудальном отделе эпидидимиса (рис. 1, А). Активность супероксиддисмутазы (рис. 1, В) в условиях гипоксии оказалась ниже, чем в группе контроля, при этом понижение её активности не было тканеспецифичным. Однако приём препаратов неоди­наково повлиял на исследуемый показатель в проксимальном и дистальном отделах: отмечено повышение активности супероксиддисмутазы при введении L-NAME в обеих частях эпидидимиса относительно состояния гипоксии, но введение L-аргинина привело к повышению активности супероксиддисмутазы только в головке придатка яичка. Выявлена умеренная корреляционная связь между уровнем оксида азота (II) и активностью супероксиддисмутазы в митохондриях хвоста эпидидимиса: r=0,46 (р=0,0087). Однако в митохондриях головки эпидидимиса корреляция показателей статистически не подтверждается: r=0,23 (р=0,2).

 

Рис. 1. А — сравнение количества метаболитов оксида азота (II) (в нмоль/мг белка); В — активность супероксиддисмутазы (в у.е./мг белка); *p <0,05 по сравнению с группой контроля; #p <0,05 по сравнению с группой хронической нормобарической гипоксии (ХНГ); L-NAME — метиловый эфир L-нитроаргинина

 

Отмечено значительное возрастание площади под кривой спектра поглощения ДНФГ-производных при хронической гипоксии в головке эпидидимиса (рис. 2, А).

Заметим, что особенно выражено увеличение доли альдегидов нейтрального характера (табл. 1), что служит признаком развития острого окислительного стресса, приводящего к фрагментации белков.

 

Таблица 1. Площадь под кривой спектра поглощения 2,4-ДНФГ-производных, Me [Q1; Q3], у.е./мг белка

Ткань

Показатель

Первая группа: контроль

Вторая группа: ХНГ

Третья группа:
ХНГ + L-NAME

Четвёртая группа: ХНГ + L-аргинин

Головка эпидидимиса

SОБЩАЯ

17,89 [15, 31; 27, 62]

319,12 [240, 98; 363, 63]*

39,89 [29, 25; 43, 17]*

37,25 [34, 91; 40, 96]*

SАДНФГнейтр

13,12 [10, 59; 17, 59]

295,18 [228, 97; 336, 51]*

25,6 [19, 02; 27, 89]*

23,32 [19, 3; 26, 74]*

SАДНФГосн

1,7 [1, 43; 3, 44]

8,77 [6, 27; 10, 62]*

5,32 [3, 77; 6, 11]*

5,95 [8, 54; 10, 08]

SКДНФГнейтр

3,08 [2, 76; 4, 93]

11,86 [7, 36; 12, 64]*

7,73 [6, 46; 8, 52]

7,79 [7, 22; 9, 68]

SКДНФГосн

0,28 [0, 19; 0, 49]

1,46 [1, 07; 1, 85]*

0,7 [0, 54; 0, 92]*

0,93 [0, 87; 0, 96]

Хвост эпидидимиса

SОБЩАЯ

16,78 [7, 85; 41, 2]

41,28 [36, 4; 43, 57]

29,99 [27, 06; 30, 77]**

30,22 [22, 03; 32, 75]*

SАДНФГнейтр

9,64 [4, 04; 24, 51]

28,84 [24, 19; 30]

17,61 [15, 28; 19, 2]*

19,63 [14, 32; 20, 71]*

SАДНФГосн

2,92 [1, 38; 7, 45]

5,16 [4, 95; 6, 09]

4,08 [3, 58; 5, 38]

4,6 [3, 42; 5, 16]

SКДНФГнейтр

3,73 [2, 16; 7, 91]

6,46 [6, 09; 7, 03]

6,29 [5, 87; 7, 76]

4,96 [3, 75; 5, 76]*

SКДНФГосн

0,52 [0, 26; 1, 33]

0,85 [0, 71; 1]

0,46 [0, 36; 0, 6]*

0,73 [0, 54; 0, 86]

Примечания: ДНФГ — динитрофенилгидразон; ХНГ — хроническая нормобарическая гипоксия; L-NAME — метиловый эфир L-нитроаргинина; SОБЩАЯ — общая площадь под кривой спектра поглощения динитрофенилгидразонов; SАДНФГнейтр — площадь альдегиддинитрофенилгидразонов нейтрального характера; SАДНФГосн — площадь альдегиддинитрофенилгидразонов основного характера; SКДНФГнейтр — площадь кетондинитрофенилгидразонов нейтрального характера; SКДНФГосн — площадь кетондинитрофенилгидразонов основного характера; * p <0,05 при сравнении с соответствующими значениями контроля; **0,05 ≤р <0,10 при сравнении с соответствующими значениями контроля.

 

Сочетание гипоксии и дефицита оксида азота (II) характеризуется меньшим накоплением продуктов окислительной модификации белков, на что указывают снижение общей площади под кривой, уменьшение количества альдегиддинитрофенилгидразонов нейтрального и основного характера, а также кетондинитрофенилгидразонов основного характера в исследовании белков митохондрий головки эпидидимиса. В хвосте придатка яичка обнаружена тенденция к снижению общей окислительной модификации белков (рис. 2, В), при этом статистически значимые изменение зафиксированы в частях спектра, соответствующих альдегиддинитрофенилгидразонам нейтрального и кетондинитрофенилгидразонам основного характера. Курсовое введение L-аргинина животным привело к снижению накопления альдегиддинитрофенилгидразонов нейтрального характера в головке эпидидимиса, а также альдегидных и кетоновых производных нейтрального характера в хвосте эпидидимиса.

 

Рис. 2. Спектры поглощения 2,4-динитрофенилгидразин-производных аминокислот в белках; А — в митохондриях головки эпидидимиса; В — в митохондриях хвоста эпидидимиса; ось х — длина волны, ось у — условные единицы оптической плотности; ХНГ — хроническая нормобарическая гипоксия; L-NAME — метиловый эфир L-нитроаргинина

 

Ещё одной важной характеристикой оценки окислительного стресса служит резервно-­адаптационный потенциал (рис. 3). Достоверное различие в изменении резервно-адаптационного потенциала отмечено только между первой и второй группами в головке придатка яичка. При этом заметно, что доля спонтанной модификации белков в хвосте придатка яичка во всех группах примерно одинакова.

 

Рис. 3. Сравнение изменения резервно-адаптационного потенциала; 100% — металл-зависимая окислительная модификация белков (ОМБ), моделируемая в лабораторных условиях, окрашенная часть шкалы — доля спонтанной окислительной модификации белков от металл-зависимой (%), неокрашенная часть шкалы — резервно-адаптационный потенциал (доля потенциально возможной окислительной модификации белков; %); *p <0,05 при сравнении с группой контроля; L-NAME — метиловый эфир L-нитроаргинина

Обсуждение

Резкое повышение содержания альдегидных производных аминокислот в головке эпидидимиса характеризует развитие карбонильного стресса в ответ на хроническую нормобарическую гипоксию. При этом резервно-адаптационный потенциал резко снижается, что свидетельствует о высокой степени участия металлов переменной валентности в повреждении аминокислот, в частности лизина, метионина и цис­теина [11].

Снижение количества оксида азота (II) на фоне хронической нормобарической гипоксии и недостоверное повышение содержания альдегидных производных аминокислот в хвосте эпидидимиса можно объяснить тем, что оксид азота (II) в этом случае выступил в качестве регулятора окислительных процессов, образуя с металлами комплексы [9]. В пользу этой теории свидетельствует и отсутствие характерного пика на кривой спектра поглощения в диапазоне 254–280 нм (см. рис. 2, В), где регистрируются производные альдегиддинитрофенилгидразонов нейтрального характера у животных, получавших L-аргинин. При этом отмечено наименьшее количество метаболитов NO среди всех представленных групп (см. рис. 1, А).

Очевидно, в регуляции окислительно-восстановительного статуса митохондрий изучаемых тканей важную роль играет именно пул оксида азота (II) [35], благодаря которому возможно поддержание его количества относительно стабильным в условиях экспериментально изменённого его синтеза.

Отсутствие изменения окислительной модификации белков в хвосте эпидидимиса и выраженная реакция в ответ на хроническую нормобарическую гипоксию в митохондриях головки эпидидимиса свидетельствуют об особом влиянии окислительного стресса во время синтеза сперматозоидов, поскольку именно в головке находятся новообразованные половые клетки, а в хвосте — образованные ранее и находящиеся там на хранении. Это может стать объяснением задержки ответа на стрессовый фактор.

Считают, что плотное расположение сперматозоидов и относительно низкая метаболическая активность в дистальном отделе эпидидимиса становятся препятствиями к насыщению клеток кислородом [36, 37]. Этот феномен позволяет предотвращать образование активных форм кислорода, что служит для предохранения половых клеток от повреждений и сохранения их функциональной активности. Возможно, невысокая степень изменений в хвосте по сравнению с головкой обусловлена этим. Подкреплением данного вывода можно считать относительно стабильный уровень резервно-­адаптационного потенциала в этом участке ­органа.

Известно, что в придатке яичка высокий уровень экспрессии белков дефензинов, частично способствующих увеличению проницаемости мембраны [38]. Наличие пептидов, богатых остатками цистеина, и является предпосылкой к значительному накоплению продуктов окислительной модификации белков в головке. Возможно, происходит усиление экспрессии дефензинов в ответ на гипоксию, о чём есть упоминания в исследованиях других авторов [39, 40]. Ещё одна работа описывает роль дефензинов при гипоксии — подавление чрезмерной неоваскуляризации [41]. Тогда увеличение окислительной модификации белков можно объяснить с позиции увеличения субстратов для атаки свободных радикалов и оксида ­азота (II).

Поскольку ключевую роль в развитии окислительного стресса играют скорость накопления активных форм кислорода и эффективность антиоксидантных ферментов, важно рассмотрение изменения активности супероксиддисмутазы в изучаемых условиях. Как видно из результатов (см. рис. 1, В), хроническая нормобарическая гипоксия привела к снижению активности этого фермента во всех исследуемых частях органа по сравнению с группой контроля. Данные, полученные нами, сопоставимы с ранее опубликованными исследованиями пациентов с хронической обструктивной болезнью лёгких [10].

Применение заявленных препаратов — L-аргинина и L-NAME — при гипоксии способствует поддержанию высокого уровня активности супероксиддисмутазы в головке придатка яичка по сравнению с группой животных, подвергшихся воздействию только гипоксии. В митохондриях головки эпидидимиса увеличение активности супероксиддисмутазы в присутствии препаратов послужило фактором защиты от повреждения аминокислот нейтрального характера. В хвосте эпидидимиса отмечено повышение активности фермента в группе животных, получавших ингибитор синтазы оксида азота. Корреляционная связь между содержанием метаболитов оксида азота (II) и активностью супероксиддисмутазы указывает на потенциал использования в качестве антиоксиданта L-аргинина как донора NO в реакции, катализируемой NO-синтазой.

Выводы

  1. Выявлен различный адаптационный потенциал митохондрий головки и хвоста придатка яичка к нормобарической хронической гипоксии, что в условиях экспериментальной модели подтверждается повышением уровня окислительной модификации белков в первом случае и отсутствием его повышения во ­втором.
  2. Дефицит кислорода вызывает повреждение аминокислот основного и нейтрального характера в белках митохондрий головки эпидидимиса.
  3. Снижение уровня оксида азота (II) в условиях хронической нормобарической гипоксии ассоциировано с уменьшением степени окислительного стресса, что выражается в уменьшении количества продуктов окислительной модификации белков и повышении активности супероксиддисмутазы на фоне введения метилового эфира L-нитроаргинина. Введение L-аргинина животным на фоне дефицита кислорода приводит к понижению окислительной модификации белков.

 

Участие авторов. Ю.А.М. — сбор и обработка материала, статистическая обработка, написание текста; В.И.З. — концепция и дизайн исследования, редактирование; А.В.П. — сбор и обработка материала, графический дизайн.
Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке ФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова» Минздрава России.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

×

About the authors

Yuliya A. Marsyanova

Ryazan State Medical University named after I.P. Pavlov

Author for correspondence.
Email: yuliyamarsyanova@yahoo.com
ORCID iD: 0000-0003-4948-4504
SPIN-code: 4075-3169

Assist., Depart. of Biological Chemistry with the Course of Clinical Laboratory Diagnostics

Russian Federation, Ryazan, Russia

Valentina I. Zvyagina

Ryazan State Medical University named after I.P. Pavlov

Email: vizvyagina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2800-5789

Cand. Sci. (Biol.), Assoc. Prof., Depart. of Biological Chemistry with the Course of Clinical Laboratory Diagnostics

Russian Federation, Ryazan, Russia

Artem V. Petrov

Ryazan State Medical University named after I.P. Pavlov

Email: chasedflea089@icloud.com
ORCID iD: 0000-0002-0639-3891

student

Russian Federation, Ryazan, Russia

References

  1. Fainberg J, Kashanian JA. Recent advances in understanding and managing male infertility. F1000Res. 2019;8:670. doi: 10.12688/f1000research.17076.1.
  2. Chen PS, Chiu WT, Hsu PL, Lin SC, Peng IC, Wang CY, Tsai SJ. Pathophysiological implications of hypoxia in human diseases. J Biomed Sci. 2020;27(1):63. doi: 10.1186/s12929-020-00658-7.
  3. Novikov VE, Levchenkova OS, Pozhilova EV. Role of reactive oxygen species in cell physiology and pathology and their pharmacological regulation. Reviews on clinical pharmacology and drug therapy. 2014;12(4):13–21 (In Russ.) doi: 10.17816/RCF12413-21.
  4. Bell EL, Klimova TA, Eisenbart J, Moraes CT, Murphy MP, Budinger GR, Chandel NS. The Qo site of the mitochondrial complex III is required for the transduction of hypoxic signaling via reactive oxygen species production. J Cell Biol. 2007;177:1029–1036. doi: 10.1083/jcb.200609074.
  5. Urata K, Narahara H, Tanaka Y, Egashira T, Takayama F, Miyakawa I. Effect of endotoxin-induced reactive oxygen species on sperm motility. Fertil Steril. 2001;76(1):163–166. doi: 10.1016/s0015-0282(01)01850-7.
  6. Palladino MA, Powell JD, Korah N, Hermo L. Expression and localization of hypoxia-inducible factor-1 subunits in the adult rat epididymis. Biol Reprod. 2004;70(4):1121–1130. doi: 10.1095/biolreprod.103.023085.
  7. Perry AC, Jones R, Hall L. Isolation and characterization of a rat cDNA clone encoding a secreted superoxide dismutase reveals the epididymis to be a major site of its expression. Biochem J. 1993;293(1):21–25. doi: 10.1042/bj2930021.
  8. Sullivan R, Mieusset R. The human epididymis: its function in sperm maturation. Hum Reprod Update. 2016;22(5):574–587. doi: 10.1093/humupd/dmw015.
  9. Lobanova EG, Kondratiyeva EV, Mineyeva EE, Karaman YuK. The membrane potential of mitochondria of thrombocytes in patients with chronic obstructive disease of lungs. Clinical laboratory diagnostics. 2014;59(6):13–16. (In Russ.)
  10. Belskikh ES, Uryasev OM, Zvyagina VI, Faletrova SV. Investigation of oxidative stress and function of mitochondria in mononuclear leukocytes of blood in patients with chronic bronchitis and with chronic obstructive pulmonary disease. Eruditio Juvenium. 2018;6(2):203–210. (In Russ.) doi: 10.23888/HMJ201862203-210.
  11. Fomina MA. Sposob kompleksnoy otsenki soderzhaniya produktov okislitel'noy modifikatsii belkov v tkanyakh i biologicheskikh zhidkostyakh. Metodicheskie rekomendatsii. (A method for a comprehensive assessment of the content of products of oxidative modification of proteins in tissues and biological fluids. Guidelines.) Ryazan': RIO RyazGMU; 2014. 60 p. (In Russ.)
  12. Kosmachevskaya OV, Nasybullina EI, Shumaev KB, Novikova NN, Topunov AF. Influence of iron complexes with nitric oxide on the reactivity of hemoglobin cysteines. Applied Biochemistry and Microbiology. 2020;56(5):512–520. doi: 10.1134/S0003683820050099.
  13. Levenez M, Lambrechts K, Mrakic-Sposta S, Vezzoli A, Germonpré P, Pique H, Virgili F, Bosco G, Lafère P, Balestra C. Full-face mask use during scuba diving counters related oxidative stress and endothelial dysfunction. Int J Environ Res Public Health. 2022;19(2):965. doi: 10.3390/ijerph19020965.
  14. Luk’yanova LD, Kirova YuI, Sukoyan GV. Signal mechanisms of adaptation to hypoxia and their role in systemic regulation. Biologicheskie membrany. 2012;29(4):238. (In Russ.)
  15. Gao F, Hayashi Y, Saravanaperumal SA, Gajdos GB, Zhong J, Kaur J, Ordog Т. Hypoxia-Inducible Factor 1 Alpha (HIF1A) cooperates with the cohesin complex component Rad21 to stimulate neuronal Nitric Oxide Synthase (NOS1) Transcription by modifying chromatin conformation. Gastroenterology. 2019;156(6):211. doi: 10.1016/s0016-5085(19)37324-x.
  16. Shemarova I, Nesterov V, Emelyanova L, Korotkov S. Mitochondrial mechanisms by which gasotransmitters (H2S, NO and CO) protect cardiovascular system against hypoxia. Front. Biosci. (Schol Ed). 2021;13(2):105–130. doi: 10.52586/S556.
  17. Miranda KM, Ridnour LA, McGinity CL, Bhattacharyya D, Wink DA. Nitric oxide and cancer: When to give and when to take away? Inorg Chem. 2021;60(21):15941–15947. doi: 10.1021/acs.inorgchem.1c02434.
  18. Gudyrev OS, Faitelson AV, Sobolev MS, Pokrovskiy MV, Pokrovskaya TG, Korokin MV, Povetka EE, Miller ES, Soldatov VO. A study of osteoprotective effect of l-arginine, l-norvaline and rosuvastatin on a model of hypoestrogen-induced osteoporosis in rats. IP Pavlov russian medical biological herald. 2019;27(3):325–332. (In Russ.) doi: 10.23888/PAVLOVJ2019273325-332.
  19. Brown GC, Cooper CE. Nanomolar concentrations of nitric oxide reversibly inhibit synaptosomal respiration by competing with oxygen at cytochrome oxidase. FEBS Lett. 1994;356(2–3):295–298. doi: 10.1016/0014-5793(94)01290-3.
  20. Hagen T, Taylor CT, Lam F, Moncada S. Redistribution of intracellular oxygen in hypoxia by nitric oxide: effect on HIF1alpha. Science. 2003;302(5652):1975–1978. doi: 10.1126/science.1088805.
  21. Zvyagina VI, Bel’skikh ES, Medvedev DV, Golovach NA. Studying the functional condition of rat epididymis mitochondria at nitric oxide (II) synthesis change. Kazan Medical Journal. 2015;96(5):814–818. (In Russ.) doi: 10.17750/KMJ2015-814.
  22. Cai Z, Yan LJ. Protein oxidative modifications: Beneficial roles in disease and health. J Biochem Pharmacol Res. 2013;1(1):15–26. PMID: 23662248.
  23. Kosmachevskaya OV, Shumaev KB, Topunov AF. Electrophilic signaling: The role of reactive carbonyl compounds. Biochemistry (Mosc). 2019;84:S206–S224. doi: 10.1134/S0006297919140128.
  24. Wetzelberger K, Baba SP, Thirunavukkarasu M, Ho YS, Maulik N, Barski OA, Conklin DJ, Bhatnagar A. Postischemic deactivation of cardiac aldose reductase: role of glutathione S-transferase P and glutaredoxin in regeneration of reduced thiols from sulfenic acids. J Biol Chem. 2010;285(34):26135–26148. doi: 10.1074/jbc.M110.146423.
  25. Zepeda AB, Calaf GM, Figueroa CA, Farías JG. Blueberries prevent the effect of intermittent hypobaric hypoxia in rat epididymis. Andrologia. 2014;46(7):766–769. doi: 10.1111/and.12146.
  26. Zhang X, Zeng W, Zhang Y, Yu Q, Zeng M, Gan J, Zhang W, Jiang X, Li H. Focus on the role of mitochondria in NLRP3 inflammasome activation: A prospective target for the treatment of ischemic stroke (Review). Int J Mol Med. 2022;49(6):74. doi: 10.3892/ijmm.2022.5130.
  27. Stasyuk ON, Alfonsova EV, Avseenko ND. Experimental study on the influence of oxygen deficiency at the acid-base of state. Modern Problems of Science and Education. 2016;(6):130–137. (In Russ.) doi: 10.17513/spno.25558.
  28. Ball MK, Waypa GB, Mungai PT, Nielsen JM, Czech L, Dudley VJ, Beussink L, Dettman RW, Berkelhamer SK, Steinhorn RH, Shah SJ, Schumacker PT. Regulation of hypoxia-induced pulmonary hypertension by vascular smooth muscle hypoxia-inducible factor-1α. Am J Respir Crit Care Med. 2014;189(3):314–324. doi: 10.1164/rccm.201302-0302OC.
  29. Marsyanova YuA, Zvyagina VI, Suchkova ON. Method of modeling of normobaric chronic hypoxia in male rats of wistar line. Eruditio Juvenium. 2022;10(2):147–156. (In Russ.) doi: 10.23888/HMJ2022102147-156.
  30. Wang ZY, Hakanson R. Role of nitric oxide (NO) in ocular inflammation. Br J Pharmacol. 1995;116:244–245. doi: 10.1111/j.1476-5381.1995.tb15094.x.
  31. Arapova AI, Fomina MA. Autocatalytic effect of lysosomal cysteine proteases smooth muscle rat aorta. Eruditio Juvenium. 2015;(4):27–32. (In Russ.)
  32. Arutyunyan AV. Metody otsenki svobodnoradikal'nogo okisleniya i antioksidantnoy sistemy organizma. (Methods for assessing freeradicaloxidation and the antioxidant system of the body.) SPb.: Foliant; 2000. 104 p. (In Russ.)
  33. Metelskaya VA. Screening as a method for determining the serum level of nitric oxide metabolites. Clinical laboratory diagnostics. 2005;(6):15–18. (In Russ.)
  34. Abalenikhin АА, Abalenikhina YV, Gruzdev EE. The program for determining the level of carbonyl derivatives of proteins and reserve-adaptive potential in normal and pathological conditions. Certificate of state registration of the computer program No. 2020611566, issued at 04.02.2020. (In Russ.)
  35. Vanin AF. Dinitrosyl iron complexes with thiol-containing ligands as a “working form” of endogenous nitric oxide. Nitric Oxide. 2016;54:15–29. doi: 10.1016/j.niox.2016.01.006.
  36. Cross BA, Silver IA. Neurovascular control of oxygen tension in the testis and epididymis. J Reprod Fertil. 1962;3:377–795. doi: 10.1530/jrf.0.0030377.
  37. Caballero J, Frenette G, Sullivan R. Post testicular sperm maturational changes in the bull: important role of the epididymosomes and prostasomes. Vet Med Int. 2010;2011:757194. doi: 10.4061/2011/757194.
  38. Vaara M. Agents that increase the permeability of the outer membrane. Microbiol Rev. 1992;56(3):395–411. doi: 10.1128/mr.56.3.395-411.1992.
  39. Zorina OA, Boriskina OA, Basova AA, Tupicin AA, Prohodnaja VA. Hypoxia-dependent control of the activity of innate antimicrobial immunity in patients with dentin caries. Stomatologiya. 2019;98(5):60–65. (In Russ.) doi: 10.17116/stomat20199805160.
  40. Nickel D, Busch M, Mayer D, Hagemann B, Knoll V, Stenger S. Hypoxia triggers the expression of human β defensing 2 and antimicrobial activity against Mycobacterium tuberculosis in human macrophages. J Immunol. 2012;188(8):4001–4007. doi: 10.4049/jimmunol.1100976.
  41. Economopoulou M, Bdeir K, Cines DB, Fogt F, Bdeir Y, Lubkowski J, Lu W, Preissner KT, Hammes HP, Chavakis T. Inhibition of pathologic retinal neovascularization by alpha-defensins. Blood. 2005;106(12):3831–3838. doi: 10.1182/blood-2005-03-0889.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Рис. 1. А — сравнение количества метаболитов оксида азота (II) (в нмоль/мг белка); В — активность супероксиддисмутазы (в у.е./мг белка); *p <0,05 по сравнению с группой контроля; #p <0,05 по сравнению с группой хронической нормобарической гипоксии (ХНГ); L-NAME — метиловый эфир L-нитроаргинина

Download (31KB)
Indexing metadata
3. Рис. 2. Спектры поглощения 2,4-динитрофенилгидразин-производных аминокислот в белках; А — в митохондриях головки эпидидимиса; В — в митохондриях хвоста эпидидимиса; ось х — длина волны, ось у — условные единицы оптической плотности; ХНГ — хроническая нормобарическая гипоксия; L-NAME — метиловый эфир L-нитроаргинина

Download (50KB)
Indexing metadata
4. Рис. 3. Сравнение изменения резервно-адаптационного потенциала; 100% — металл-зависимая окислительная модификация белков (ОМБ), моделируемая в лабораторных условиях, окрашенная часть шкалы — доля спонтанной окислительной модификации белков от металл-зависимой (%), неокрашенная часть шкалы — резервно-адаптационный потенциал (доля потенциально возможной окислительной модификации белков; %); *p <0,05 при сравнении с группой контроля; L-NAME — метиловый эфир L-нитроаргинина

Download (26KB)
Indexing metadata

© 2022 Eco-Vector