Mechanism and diagnostic capabilities of the reaction of nitroblue tetrazolium reduction by human neutrophils

Full Text

К достоинствам методов цитохимического исследования относятся техническая простота, доступность, минимальные требования к объему исследуемого материала. Это делает реальным их внедрение в повседневную практику клинических лабораторий. Вместе с тем они позволяют обнаружить такие изменения в нейтрофилах, которые сложно, а порой невозможно выявить при помощи других, гораздо более трудоемких методов.

Реакция бессубстратного восстановления нитросинего тетразолия нейтрофилами человека (HCT-тест) была описана в 1967—1968 гг. [15]. С тех пор HCT-тест прошел широкую научно-практическую апробацию. Принцип метода состоит в том, что ИСТ, сталкиваясь с активированным нейтрофилом, восстанавливается в диформазан, который в виде гранул, не растворимых в воде и большинстве органических растворителей, откладывается внутри или на поверхности клеток¹ Количество выпавшего диформазана служит мерилом интенсивности реакции. Диформазан можно экстрагировать горячим пиридином, диоксаном, диметилсульфоксидом и затем определить оптическую плотность на спектрофотометре, но чаще пользуются обычной микроскопией, подсчитывая процент нейтрофилов, содержащих диформазан. Это проще и экономичнее — расход крови сведен к минимуму, что нередко определяет выбор методики (например, в педиатрии). Есть предложение учитывать HCT-тест, подобно другим цитохимическим реакциям, по степеням активности цитохимического показателя [3, 11]^[2]. Кроме нейтрофилов, восстановление НСТ происходит в моноцитах и тромбоцитах. Их влияние на оценку результатов исключают, контрастируя ядра любым красителем, который по цвету отличается от диформазана.

Один из главных механизмов, приводящих к образованию диформазана, можно представить следующим образом (см. рис.). Стимуляция нейтрофила растормаживает НАДФ·H₂-оксидазу, которая, окисляя НАДФ·Н₂ до НАДФ, активирует гексозомонофосфатный шунт (ГМФШ). По законам внутриклеточного гомеостаза ГМФШ нарабатывает новую порцию НАДФ·Н₂, замыкая положительную обратную связь. Электроны, снимаемые с НАДФ·Н₂ переводят молекулярный кислород в супероксидный анион, которому принадлежит непосредственная роль в восстановлении НСТ [17]. В целом HCT-тест отражает степень активации кислородзависимого метаболизма нейтрофила, прежде всего функцию ГМФШ и связанную с ним наработку высокореактогенных свободных радикалов.

 

Основная цепь реакций, приводящих к восстановлению НСТ стимулированным нейтрофилом. ГМФШ— гексозомонофосфатный шунт; О₂ — супероксид-анион; НАДФ— никотинамидадениндинуклеотидфосфат; НАДФ·Н₂ — восстановленная форма никотин-амидадениндинуклеотидфосфата.

 

НАДФ·Н₂-оксидаза локализуется в плазматической мембране и при фагоцитозе вместе с ней инвагинируется внутрь клетки. Поэтому активация, связанная с поглотительной реакцией нейтрофила, сопровождается внутрифагосомальным восстановлением НСТ [16]. При стимуляции растворимыми агентами фагосом не образуется и диформазан откладывается на плазматической мембране.

Сказанное выше определяет возможности и сферу применения HCT-теста в клинико-лабораторных и научных исследованиях. Нейтрофилы крови в норме пребывают в покоящемся (неактивированном) состоянии и поэтому в подавляющем большинстве не восстанавливают НСТ. Число нейтрофилов, которые метятся диформазаном, у здоровых людей, как правило, не превышает 10%. Увеличение этого показателя говорит о сдвигах во внутренней среде организма, которые можно квалифицировать как нарушение гомеостаза. Анализ причин, спровоцировавших реактивные изменения в нейтрофилах, составляет основное клиническое содержание подобных исследований. Этот вариант мы называем спонтанным HCT-тестом, имея в виду, что он проводится без дополнительной стимуляции клеток. Подобно другим цитохимическим индикаторам, спонтанный HCT-тест отражает степень функционального раздражения нейтрофилов in vivo, являясь своеобразным зеркалом гомеостаза.

Метаболическую активацию нейтрофилов можно воспроизвести in vitro. Вариант ее регистрации при помощи реакции восстановления НСТ мы называем индуцированным HCT-тестом. Он характеризует функциональный резерв нейтрофилов, вскрывая их потенциальную способность ответить респираторным взрывом на адекватное раздражение.

Появившись около десяти лет назад, HCT-тест не стал очередным «украшением» арсенала цитохимических приемов в изучении нейтрофила. По информативности он быстро выдвинулся на одно из первых мест наряду с такими интегральными показателями, как случайная миграция, хемотаксис, бактерицидность, адгезивность и пр. Преимущества HCT-теста перед другими цитохимическими методами определяются, на наш взгляд, двумя главными причинами. Во-первых, HCT-тест выявляет компоненты, которых нет (или почти нет) в покоящемся нейтрофиле. Они возникают только при стимуляции, а потому отлично дифференцируют интактные и активированные клетки. Минимальные показатели спонтанного HCT-теста у здоровых служат четким критерием для отсчета патологических сдвигов и уровня искусственно наведенной активации. Другие цитохимические реакции менее альтернативны, ибо в той или иной степени они воспроизводимы с большинством нестимулированных нейтрофилов. Это затрудняет трактовку индивидуальных показателей, ограничивая исследования рамками популяционного анализа (сопоставление средних величин). Второе достоинство НСТ-теста заключается в том, что он отражает итоговую реакцию одной из ключевых ферментных систем, ответственных за бактерицидность нейтрофила [18].

Нарушение способности к восстановлению НСТ совпадает с патологией кислородо зависимого аппарата бактерицидности [15]. Отсюда индуцированный HCT-тест можно рассматривать как цитохимический критерий готовности нейтрофилов к завершенному фагоцитозу. Следует помнить, что индуцированный HCT-тест с цельной кровью не вычленяет дефектов собственно нейтрофилов и гуморального (опсонического) звена фагоцитарной системы. Интеграция фактов на таком уровне имеет свою логику, ибо с практической точки зрения важно знать состояние фагоцитарной функции в целом. Чтобы решить вопрос о локализации дефекта, требуется раздельное изучение реактивности нейтрофилов и опсонических свойств плазмы [3].

Большое внимание привлекает применение HCT-теста для дифференциации бактерийных и вирусных инфекций. Как было впервые установлено Парком и соавт. (1968), спонтанный HCT-тест повышен у большинства больных с острыми пиогенными инфекциями и обычно не меняется при заболеваниях вирусной этиологии. В последующем эти данные в целом были подтверждены [12—14]. Вместе с тем было замечено, что спонтанный HCT-тест иногда повышен при заболеваниях, не связанных с острой инфекционной патологией, или, напротив, не меняется, несмотря на присоединение бактериальных инфекций. Такие результаты относят к «ложноположительным» и «ложноотрицательным», подразумевая их дезориентирующую роль в клинике инфекционных заболеваний (см. табл.). Причиной «ложноотрицательных» результатов является слабая стимуляция периферических нейтрофилов при недостаточной генерализации инфекционного процесса, либо (если процесс генерализован) врожденная или приобретенная патология нейтрофилов. В последнем случае низкие показатели HCT-теста служат плохим прогностическим признаком. Обе причины легко отдифференцировать, проверив активность нейтрофилов в индуцированном НСТ-тесте. «Ложноположительные» результаты до сих пор не получили должного объяснения и клинического толкования. Несомненно, как и при бактерийных инфекциях, нейтрофилы активируются in vivo медиаторными продуктами плазмы, клеток крови [6], а возможно, и непосредственно экзогенными агентами.

 

Причины «ложноположительных» и «ложноотрицательных» результатов спонтанного НСТ-теста

«Ложноположительные  результаты»

«Ложноотрицательные  результаты»

Новорожденные (до 2 месяцев) Гемофилия Остеогенная недостаточность Инфаркт миокарда Полицитемия Гемодиализ Синдром Чедиака-Хигасши Талассемия Лимфопролиферативные заболевания Протозойные инфекции (малярия, амебные абсцессы печени, лейшманиоз) Вакциональные реакции Радиотерапия Пероральная контрацептивная терапия Вирусная энцефалиты (коревой, паротитный, эховирусы) Период реконвалесценции после бактерийных инфекций Болезни иммуных комплексов (ревматоидный артрит) Циркулирующие иммунные комплексы Аллергические заболевания

Хронический системный гранулематоз Врожденная или приобретенная агамма-глобулинемия Серповидноклеточная анемия Системная красная волчанка Сахарный диабет Квашиоркор Тяжелые ожоги Лечение цитостатиками, кортикостероидами, фенилбутазоном Тяжелые дистрофические процессы (алкоголизм, нефрозы) Хирургический стресс Сочетание с гриппозной и некоторыми другими вирусными инфекциями Некоторые формы локальных пиогенных инфекций (аппендицит)

 

Анализ подобных ситуаций с позиций реактивности нейтрофила принесет, по нашему мнению, большую пользу в изучении вопросов патогенеза, лабораторной диагностики и контроля за течением целого ряда патологических процессов. Именно здесь с наибольшей вероятностью может проявиться роль нейтрофила (и, конкретно, НСТ-теста) как тонкого индикатора нарушений гомеостаза.

В нашей лаборатории было показано, что спонтанный HCT-тест улавливает такие- отклонения в организме человека, которые не регистрируются общепринятыми клинико-лабораторными методами и другими цитохимическими маркерами нейтрофила (щелочная фосфатаза, миелопероксидаза). Например, спонтанный HCT-тест повышен почти у половины больных с аллергическими заболеваниями. Он оказался значительно информативнее, чем эозинофилия — признанный и пока единственный общий показатель активности аллергического процесса [8]. Спонтанный HCT-тест может быть использован как диагностический и прогностический признак латентно протекающего- пиелонефрита у детей. По показателям HCT-теста предложено судить о динамике- некоторых заболеваний крови [1, 7]. Высокая чувствительность и лабильность реакций, лежащих в основе HCT-теста, делают его ценным методом для контроля за развитием инфекции у восприимчивых больных, например, при оценке эффективности антибактериальной терапии [19]. Если лечение выбрано правильно, процент активированных нейтрофилов обычно быстро возвращается к норме. Антибиотики рекомендуется назначать только тем больным, у которых результат спонтанного НСТ-теста превышает 20%.

В 1967 г. Бехнер и Натан обнаружили, что нейтрофилы детей, страдающих системным хроническим гранулематозом, не восстанавливают НСТ [15]. Поглощение к образование фаголизосом происходят нормально, но поглощенные бактерии остаются жизнеспособными, дети погибают от рецидивирующих нагноительных процессов (гранулемы), вызываемых нормально персистирующими пиогенными бактериями — обычно стафилококками и грамотрицательными палочками. Оказалось, что нарушение бактерицидной функции отражает врожденную патологию ГМФШ (дефект по глюкозо-6- фосфат-дегидрогеназе), которая блокирует наработку кислородзависимых бактерицидных факторов. С этого момента началось применение индуцированного HCT-теста для скрининга системного гранулематоза и пограничных с ним клинических состояний. Одновременно стало очевидным, что HCT-тест может быть полезен при изучении более широкого круга вопросов, связанных с функциональным состоянием нейтрофильного фагоцитоза и его потенциальных ресурсов. Потребность в такой информации передо возникает в клинической практике в связи с прогнозом инфекционных осложнений. Допускается, что низкая реактивность нейтрофилов в индуцированном НСТ-тесте представляет собой неблагоприятный прогностический признак [5]. Б подтверждение приведем пример из работы, выполненной в нашей лаборатории [10]. При изучении острой респираторной патологии у новорожденных было обнаружено резкое ослабление индуцированного HCT-теста у большинства детей, у которых ОРЗ осложнилось пневмонией. У части из них снижение показателя выявлено за 2—3 дня до развития клинических признаков воспаления легких. Это явилось основанием рекомендовать индуцированный HCT-тест для определения группы больных с повышенным риском осложнения пневмонией. Заметим, что спонтанный HCT-тест в тех же исследованиях не давал клинически значимой информации.

Говоря о принципиальных возможностях HCT-теста, мы сознательно опустили изложение частных деталей, зафиксированных в многочисленных публикациях зарубежных, а в последние годы — и отечественных авторов. Они лишь глубже подчеркивают большой интерес к этому методу и практическую ценность основанных на нем выводов.

По-видимому, настал момент, когда из всех щитохимических реакций, предложенных для изучения нейтрофила, следует отобрать наиболее простые и информативные и включить их в число стандартных методов клинических лабораторий. Одним из первых кандидатов на эту роль, несомненно, является НСТ-тест

Применение HCT-теста не ограничено рамками клинико-лабораторной практики. Информативность и возможность точной количественной оценки сделали его одним из постоянных методов фундаментальных исследований. Здесь он успешно соседствует (а иногда конкурирует) с более сложными способами оценки метаболической активации нейтрофила — полярографией, хемилюминесценцией, изотопной маркировкой промежуточных и конечных метаболитов. 

 

¹ НСТ как реактив широко используется в цитохимии. Однако, в отличие от HCT-теста, его восстановление всегда происходит в присутствии неспецифических ферментных субстратов.

^[2] Технические детали постановки HCT-теста подробно изложены нами в методических рекомендациях «Способ оценки функциональной активности нейтрофилов человека по реакции восстановления нитросинего тетразолия» (Казань, 1979, утв. М3 РСФСР)

About the authors

A. N. Mayansky

Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

E. A. Pazyuk

Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

T. P. Makarova

Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

R. A. Parshakova

Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

O. I. Pikuza

Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

References

Supplementary files