Исследование метаболических нарушений у крыс при воздействии гипобарической гипоксии и разработка подходов коррекции путём одновременного воздействия на разные звенья патогенеза

Полный текст

Актуальность. Гипоксия — ведущий патогенетический фактор многих заболеваний, она затрагивает все без исключения системы как на организменном, так и на субклеточном уровнях. В наибольшей степени от гипоксии в связи с высокой интенсивностью его метаболизма страдает головной мозг [1, 2]. Изменения, обусловленные нарушением метаболических процессов, накоплением продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), вызванными гипоксией различного генеза и интенсивности, становятся одними из ведущих патогенетических факторов ухудшения когнитивно-мнестических функций.

Гипобарическая гипоксия (ГГ) — основной синдром высотной болезни. Известно, что атмосферный воздух на всех высотах на 21% состоит из кислорода, при подъёме на высоту атмосферное давление падает, снижается парциальное давление, существенно уменьшается уровень вдыхаемого кислорода. Это приводит к развитию гипоксического состояния, вызывая ряд патологических реакций, включая биохимические, молекулярные и геномные изменения, большинство из которых сосредоточены на головном мозге [3]. Кислородная недостаточность в структурах мозга приводит к развитию оксидативного стресса, запускающего процессы нейродегенерации с последующим нарушением функций нейротрансмиттерных систем [4] в первую очередь в гиппокампе и фронтальном отделе коры головного мозга, что приводит к ухудшению памяти и процессов обучения [5].

Поскольку центральными нарушениями в патогенезе гипоксических повреждений бывают изменения энергетических процессов, целостности мембранных структур и ферментных систем, необходимы профилактика и коррекция этих нарушений с помощью фармакологических веществ, способных направленно вмешиваться в процессы повышения устойчивости к гипоксическому воздействию, ускорять адаптацию и предупреждать нарушения функций мозга [6].

В настоящее время для лечения последствий гипоксического воздействия применяют антигипоксанты, повышающие устойчивость клеток к недостатку кислорода, антиоксиданты, способные нормализовать процессы ПОЛ, ноотропные средства, улучшающие функции мозга [7]. Учитывая многообразие механизмов развития гипоксических повреждений, широкий спектр неспецифических эффектов, зависящих от степени и последствий нарушений метаболизма в различных органах, необходимо применение препаратов, оказывающих одновременное воздействие на разные звенья патогенеза этих повреждений.

Ранее было показано, что инновационный препарат 2-хлорэтокси-арил-диметил-аминофенилфосфорил-ацетогидразид (КАПАХ, принятая в России транслитерация английской аббревиатуры CAPAH — от англ. 2-Chloro-
ethoxy-aryl-dimethyl-AminophenylPhosphoryl
AcetoHydrazide), находящийся на завершающей стадии доклинических исследований, обладает мультитаргетным механизмом действия, в эксперименте проявляет защитное действие при гипоксии различного генеза, предотвращает дегенерацию кортикальных нейронов крыс, подвергнутых гипоксическому воздействию [8]. Наиболее важна в спектре фармакологического действия КАПАХ его способность в широком диапазоне доз улучшать процессы памяти и обучения, нарушенные гипоксическим воздействием, выявленная в экспериментах на монгольских песчанках [9].

Цель. Учитывая вышесказанное и с целью проверки гипотезы об эффективности одновременного фармакологического воздействия на разные звенья патогенеза при гипоксии, мы сочли необходимым изучить целесообразность применения КАПАХ в предупреждении и коррекции нарушений, вызванных воздействием ГГ, и позиционировать его как потенциальное лекарственное средство с комплексным (мультитаргетным) механизмом действия для профилактики и лечения высотной болезни и других патологических гипоксических состояний.

Материал и методы исследования. Эксперименты проведены на 120 крысах-самцах линии Вистар с массой тела 180–210 г, из которых были сформированы 12 групп по 10 животных. До начала экспериментов всех животных содержали в стандартных условиях вивария с естественным световым режимом на полнорационной сбалансированной диете (ГОСТ Р 50258-92) с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997), а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ, утверждённых приказом Минздрава РФ №708н от 23.08.2010. Все исследования одобрены локальным этическим комитетом Казанского государственного медицинского университета Минздрава России (протокол №10 от 19.12.2017).

ГГ у крыс моделировали в течение 30 мин в барокамере (объём барокамеры 7,5 л, рассчитанный на одну крысу), имитируя подъём на высоту 8500 м со скоростью 500 м/мин [10].

Объектами исследования были потенциальный лекарственный препарат КАПАХ, находящийся на завершающей стадии доклинических испытаний, и ноотропный лекарственный препарат пирацетам в ампулах (АО «Органика», Россия).

Были проведены две серии экспериментов:
а) изучение биохимических показателей в сыворотке крови через 3 ч после воздействия гипоксии при профилактическом (за 40 мин до помещения крысы в барокамеру) введении препаратов;
б) изучение биохимических показателей в сыворотке крови через 24 ч после гипоксического воздействия при введении препаратов в режиме «лечения» через 1 ч после извлечения животного из барокамеры.

Отдельные группы составляли крысы, которых не подвергали воздействию ГГ (группа контрольных животных; группа крыс, которым вводили КАПАХ; группа крыс, которым вводили пирацетам). Забор крови у этих групп животных производили на тех же сроках.

Фармакологические агенты вводили однократно внутрибрюшинно: КАПАХ в дозе 1 мг/кг (1/1000 от LD501, является максимально эффективной при гипоксических воздействиях; пирацетам — в дозе 100 мг/кг, составляет 1/100 от LD50, стандартная доза как препарата сравнения, используемая в экспериментах). Крысам, подвергнутым ГГ (без коррекции КАПАХ или пирацетамом), и контрольным животным (без воздействия ГГ) в эквивалентном объёме вводили изотонический раствор натрия хлорида.

Через 3 ч (а) и 24 ч (б) у крыс из хвостовой вены забирали кровь для определения активности ферментов, после чего крыс декапитировали с использованием гильотины (установка НПО «Открытая наука») и забирали кровь для определения других биохимических показателей. Параллельно проводили быстрое выделение структур мозга (гиппокампа и фронтальной коры) для определения содержания малонового диальдегида (МДА).

Образцы сыворотки крови готовили путём отстаивания цельной крови при комнатной температуре для коагуляции и с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об./мин. Активность аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, креатинфосфокиназы, лактатдегидрогеназы, γ-глутамилтранспептидазы, а также содержание глюкозы, общего белка, триглицеридов, холестерина, β-липопротеидов, сывороточного железа и мочевой кислоты проводили на анализаторе Cobas Integra 400 Plus, Hoffman la Roche (Швейцария) с использованием монотестов той же фирмы согласно инструкции.

О накоплении МДА как основного маркёра процесса ПОЛ в структурах мозга крыс судили по реакции с тиобарбитуровой кислотой согласно методу [11]. Определение проводили на спектрофотометре BioMate 3S (Thermo Scientific, США) при длине волны 532 нм. ­Количество МДА рассчитывали в мкМ/кг сырой ткани.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы GraphPad prism 8.0.1 с вычислением t-критерия Стьюдента.

Результаты. На «высоте» 8500 м у животных отмечали признаки развития гипоксии: акроцианоз, учащение дыхания, снижение двигательной активности, увеличение количества дефекаций, развитие «бокового положения».

Острая гипоксия вызывала развитие гиперферментемии. Через 3 ч после воздействия ГГ в сыворотке крови крыс возрастала активность ферментов: аланинаминотрансферазы (ГГ 87,1±6,9 ед./л, контроль 61,7±7,5 ед./л при р=0,03), аспартатаминотрансферазы (ГГ 275,5±29,3 ед./л, контроль 185,5±23,5 ед./л при р=0,05), лактатдегидрогеназы (ГГ 3085,6±326,7 ед./л, контроль 2209,6±228,6 ед./л при р=0,02), щелочной фосфатазы (ГГ 44,8±3,5 ед./л, контроль 24,7±1,4 ед./л при р=0,015).

На рис. 1 представлена сравнительная оценка активности ферментов после воздействия ГГ на фоне профилактического введения препаратов, результаты которой для наглядности выражены в процентах.

 

Рис. 1. Активность ферментов в сыворотке крови крыс через 3 ч после воздействия гипобарической гипоксии (ГГ) при введении 2-хлорэтокси-арил-диметил-аминофенилфосфорил-ацетогидразида (КАПАХ; 1 мг/кг внутрибрюшинно) и пирацетама (100 мг/кг внутрибрюшинно) за 40 мин до помещения крысы в барокамеру. По оси абсцисс — названия ферментов; по оси ординат — активность ферментов (%) по отношению к контрольным значениям, принятым за 100%. Количество крыс в каждой группе n=10. АЛТ — аланинаминотрансфераза; АСТ — аспартатаминотрансфераза; ЛДГ — лактатдегидрогеназа; ЩФ — щелочная фосфатаза; КФК — креатинфосфокиназа; *разница достоверна по отношению к контролю; **разница достоверна по отношению к ГГ.

 

Профилактическое применение КАПАХ предупреждало развитие вызванной ГГ гиперферментемии: активность всех исследованных ферментов не отличалась от показателей контрольных значений. На фоне введения пирацетама аналогичная тенденция была отмечена только в случае с щелочной фосфатазой, тогда как активность других ферментов не отличалась от таковых у крыс с ГГ.

Результаты исследования других биохимических показателей, представленные в табл. 1, показывают, что через 3 ч после гипоксического воздействия в сыворотке крови крыс развивалась дислипидемия: уменьшилось содержание триглицеридов и увеличилась концентрация холестерина, что сопровождалось увеличением соотношения холестерин/триглицериды. Изменений остальных показателей сыворотки крови после воздействия ГГ (мочевины, креатинина, мочевой кислоты, белка, глюкозы, β-липопротеидов, железа и билирубина) на этом сроке наблюдения нами не выявлено.

 

Таблица 1. Биохимические показатели крови крыс через 3 ч после воздействия гипобарической гипоксии (ГГ) и влияние на эти показатели 2-хлорэтокси-арил-диметил-аминофенилфосфорил-ацетогидразида (КАПАХ) и пирацетама при введении за 40 мин до помещения животного в барокамеру

Группа животных	Количество в группе	Глюкоза, мМ/л, M±m	Общий белок, г/л, M±m	Триглицериды, мМ/л, M±m	Холестерин, мМ/л, M±m	Холестерин/триглицериды, M±m	β-Липопротеиды, мг/%, M±m	Мочевина, мМ/л, M±m	Креатинин, мМ/л, M±m	Железо, мМ/л, M±m	Мочевая кислота, мМ/л, M±m
Контроль	10	4,5±0,3	79,5±1,8	0,81±0,1	0,62±0,09	0,77±0,1	74,2±4,1	5,81±0,56	44,4±2,4	27,03±4,2	384,0±94,5
ГГ	10	4,6±0,3	81,7±2,5	0,53±0,06* р=0,04	0,84±0,05* р=0,03	1,66±0,3* р=0,01	68,3±5,1	5,00±0,46	45,3±1,7	27,7±3,8	433,2±10,7
КАПАХ (1 мг/кг) + ГГ	10	4,4±0,3	80,0±2,2	0,58±0,04	0,60±0,05** р=0,03	1,01±0,03** р=0,05	70,2±6,0	3,60±0,29** р=0,02	37,0±1,5** р=0,015	22,4±2,1	350,3±101,2
Пирацетам (100 г/кг) + ГГ	10	4,3±0,3	79,6±1,9	0,54±0,06	0,55±0,05** р=0,03	1,05±0,17	70,4±4,2	5,03±0,32	44,9±2,6	24,2±3,5	424,7±127,1
КАПАХ (1 мг/кг)	10	4,7±0,4	76,4±2,1	0,76±0,2	0,68±0,05	0,89±0,1	73,2±4,1	6,10±0,62	48,0±0,51	28,7±4,1	350,7±80,2
Пирацетам (100 мг/кг)	10	4,6±0,3	78,5±2,1	0,71±0,2	0,72±0,09	0,87±0,3	69,2±3,8	5,61±0,42	46,2±0,31	29,4±4,5	381±73,1

Примечание: *разница достоверна относительно контроля; **разница достоверна относительно ГГ.

 

Профилактическое введение КАПАХ предупреждало повышение уровня холестерина и изменение коэффициента холестерин/триглицериды в сыворотке крови. Кроме того, на фоне применения КАПАХ у крыс отмечено снижение содержания мочевины и креатинина по сравнению с группой ГГ. Применение пирацетама также вызывало нормализацию содержания холестерина, но показатели соотношения холестерин/триглицериды при этом не отличались от таковых в группе крыс, подвергнутых воздействию ГГ.

Результаты второй серии экспериментов продемонстрировали, что через 24 ч после воздействия ГГ в крови крыс был отмечен только повышенный уровень креатинфосфокиназы, показатели активности остальных ферментов не отличалась от контрольных (табл. 2). Применение КАПАХ после гипоксии приводило к нормализации активности креатинфосфокиназы, повышенной при гипоксическом воздействии.

 

Таблица 2. Активность ферментов крови крыс через 24 ч после воздействия гипобарической гипоксии (ГГ) и влияние на эти показатели 2-хлорэтокси-арил-диметил-аминофенилфосфорил-ацетогидразида (КАПАХ) и пирацетама при введении через 1 ч после извлечения крысы из барокамеры

Группа ­животных	Аланинаминотрансфераза, ед./л, M±m	Аспартатаминотрансфераза, ед./л, M±m	Лактатдегидрогеназа, ед./л, M±m	Креатинфосфокиназа, ед./л, M±m	γ-Глутамилтранспептидаза, ед./л, M±m
Контроль	67,37±7,90	107,37±17,91	2336,3±240,5	794,5±72,7	1,65±0,36
ГГ	77,21±13,69	134,78±23,59	2639,8±182,4	1248±109,2* р=0,01	1,46±0,44
ГГ + КАПАХ (1 мг/кг)	64,86±6,85	132,75±18,1	2131,9±286,6	867,6±100,4** р=0,03	2,92±0,71
ГГ + пирацетам (100 мг/кг)	66,75±7,35	128,75±19,1	2224,7±344,4	1195,8±119,4*	2,74±0,91
КАПАХ (1 мг/кг)	72,35±10,07	119,48±19,49	2578,0±470,1	706,2±150,9	2,57±0,27
Пирацетам (100 мг/кг)	69,47±8,90	127,35±27,91	2435,3±280,5	786,5±79,7	1,85±0,39

Примечание: *разница достоверна относительно контроля; **разница достоверна относительно ГГ.

 

Что касается биохимических показателей крови, то через 24 ч после ГГ нами не было выявлено каких-либо различий между опытными и контрольными значениями, в том числе в показателях триглицеридов и холестерина, изменение которых было отмечено через 3 ч после воздействия гипоксии.

Следует отметить, что введение КАПАХ и пирацетама крысам без воздействия гипоксии не вызывало изменений активности ферментов и других биохимических показателей сыворотки крови (см. табл. 1 и 2).

Оксидативный стресс — одно из ключевых звеньев в патогенезе ГГ и других видов гипоксий, в первую очередь он затрагивает структуры головного мозга. Исследование содержания основного маркёра активации процесса ПОЛ — МДА — в гиппокампе и фронтальной коре мозга крыс через 3 ч после воздействия ГГ показало существенное повышение его ­содержания по сравнению с контрольными животными: во фронтальной коре — в 1,9 раза (51,4±3,7 мкМоль/кг) при р=0,05 относительно контрольных крыс (27,4±2,1 мкМоль/кг); в гиппокампе — в 1,7 раза (44,2±2,8 мкМоль/кг) при р=0,01 относительно контрольных крыс (25,8±1,9 мкМоль/кг). Профилактическое введение КАПАХ уменьшало накопление МДА в обеих исследованных структурах: во фронтальной коре в 1,4 раза (39,4±1,9 мкМоль/кг), р=0,03 относительно ГГ; в гиппокампе — 1,5 раза (29,3±2,6 мкМоль/кг), р=0,02 относительно ГГ. Профилактическое введение пирацетама (100 мг/кг) не приводило к достоверному снижению уровня этого показателя по сравнению с животными после воздействия ГГ.

Обсуждение. ГГ — кардинальный признак разряженной среды, которая бывает результатом снижения барометрического давления при подъёме на высоту, понижения парциального давления и уровня кислорода во вдыхаемом воздухе, что приводит к широкому спектру неспецифических эффектов в отношении различных органов. В первую очередь и в большей степени страдает головной мозг. Исследованиями показано, что ГГ, возникающая на высоте выше 2500 м, приводит к уменьшению количества нервных клеток во фронтальной коре и гиппокампе, растворению хроматина в нейронах фронтальной коры [12]. Развивающийся окислительный стресс и сопутствующие метаболические нарушения, приводят к нарушению памяти и когнитивных функций [6, 12].

Данные литературы свидетельствуют, что наиболее существенные изменения метаболизма происходят в первые часы периода восстановления после окончания гипоксического воздействия [13, 14], поэтому на первом этапе исследований мы изучили изменения некоторых биохимических показателей через 3 ч после воздействия гипоксии.

На этом сроке отмечена выраженная гиперферментемия, проявившаяся повышением активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы, что связывают с повышением пассивной проницаемости биологических мембран, их дезорганизацией, приводящей к выходу ферментов в межтканевую жидкость и кровь, что вызывает нарушения обмена веществ и вторичную гипоксическую альтерацию тканей [15].

Нарушение целостности клеточных мембран и выход в кровь ферментов сопровождалось повышением содержания холестерина, снижением уровня триглицеридов и увеличением соотношения холестерин/триглицериды. Известно, что активация липолиза при гипоксии происходит в результате повышения активности липаз и развившегося ацидоза [3], что сопровождается накоплением избытка кетоновых тел и высших жирных кислот. Последние могут оказывать разобщающее влияние на процессы окисления и фосфорилирования, тем самым усугубляя гипоксию [16].

Среди механизмов, приводящих к повреждению биологических мембран клеток и дезинтеграции различных биосистем в условиях гипоксии, необходимо выделить, прежде всего, активацию свободнорадикального окисления липидов [6,  17]. Мозг наиболее уязвим и чувствителен к интенсификации этого процесса [5, 18], и нами также было отмечено значительное повышение содержания МДА, основного маркёра ПОЛ, в гиппокампе и фронтальной коре мозга крыс после воздействия ГГ.

Таким образом, анализ полученных нами на первом этапе результатов показал, что через 3 ч после 30-минутного воздействия ГГ развиваются многочисленные биохимические изменения в звеньях патогенеза, что свидетельствует о необходимости комплексного медикаментозного подхода для их профилактики и коррекции.

На втором этапе исследований, через 24 ч после воздействия ГГ в сыворотке крови крыс произошла нормализация многих биохимических показателей, но был отмечен повышенный уровень креатинфосфокиназы, активность которой в отличие от других ферментов не изменялась на ранней стадии. Возникает вопрос, почему активность креатинфосфокиназы в сыворотке крови повысилась только через 24 ч, тогда как высокое содержание других ферментов, обусловленное выходом в кровь из-за повреждения клеточных мембран при ГГ, к этому времени уже нормализовалось.

По-видимому, этот эффект обусловлен тем, что креатинфосфокиназа служит ферментом энергетического обмена, и при гипоксическом воздействии её содержание в крови компенсаторно повышается с целью обеспечения клеток энергией в условиях дефицита кислорода [14, 19], но это действие развивается позднее 3 ч после гипоксии, поэтому на раннем этапе восстановительного периода этих изменений мы не увидели. Следует также подчеркнуть, что через 24 ч после воздействия ГГ у крыс не произошло восстановления содержания МДА в исследуемых структурах головного мозга, уровень этого маркёра процесса ПОЛ оставался по-прежнему повышенным в гиппокампе и фронтальной коре по сравнению с крысами контрольной группы.

Относительно быстрое восстановление большинства метаболических показателей не служит доказательством восстановления всего организма и его функционирования, подтверждением чего является развитие неврологического дефицита в ранние и отдалённые сроки периода восстановления [13,  14]. По этой причине для повышения устойчивости к гипоксическому воздействию и ускорению процессов адаптации необходимо направленное применение лекарственных средств.

Способность КАПАХ предупреждать развитие гиперферментемии при применении в режиме профилактики может быть результатом доказанного нами ранее мембраностабилизирующего действия этого вещества [20], существенно ослабляющего влияние гипоксии. Этот же механизм, по-видимому, играет определённую роль в эффективности КАПАХ при введении в режиме «лечения» последствий ГГ, снижение повышенного содержания креатинфосфокиназы в крови приводит к адекватному энергообеспечению организма при ГГ.

Профилактическое введение КАПАХ предупреждало также повышение содержания в крови холестерина и приводило к нормализации показателя холестерин/триглицериды, то есть уменьшало выраженность дислипидемических расстройств, развившихся после воздействия ГГ. Кроме того, у животных, которым до воздействия гипоксии был введён КАПАХ, в крови зарегистрировано снижение содержания мочевины и креатинина по сравнению с гипоксическими животными. Этот фактор может свидетельствовать о том, что под влиянием препарата во время гипоксии, возможно, снижается интенсивность энергопотребления путём угнетения мочевинообразования, что может служить защитой клетки при гипоксии и ишемии [14, 21].

Особую ценность имеет способность ­КАПАХ снижать уровень основного маркёра процесса ПОЛ — МДА — во фронтальной коре и гиппокампе. Как уже было упомянуто выше, накопление продуктов ПОЛ в гиппокампе и фронтальной коре приводит к ухудшению памяти и когнитивных функций, а постоянный высокий их уровень приводит к развитию нейродегенеративных процессов [22]. Возможными механизмами снижения содержания МДА при введении КАПАХ может быть наличие у него как собственно антиоксидантных свойств [9], так и мембраностабилизирующего действия [9, 20]. Кроме того, нельзя исключить выявленную ранее способность КАПАХ взаимодействовать с глициновыми участками NMDA-рецепторов, тем самым модулируя высвобождение внеклеточного глутамата и накопление ионов кальция, запускающих процесс пероксидации при гипоксии [8].

Следует отметить, что препарат сравнения пирацетам заметно уступал по эффективности КАПАХ на данной модели: в меньшей степени уменьшал гиперферментемию, не устранял вызванную гипоксией дислипидемию и не вызывал снижения уровня МДА в гиппокампе и фронтальной коре.

Использование нами широко применяемого в клинической практике лекарственного средства пирацетама в качестве препарата сравнения обусловлено наличием у него антигипоксических свойств, способности корригировать нарушенные метаболические процессы и улучшать процессы памяти и обучения [23].

Способность КАПАХ снижать вызванную ГГ интенсивность процессов ПОЛ в структурах мозга с одновременной коррекцией метаболических нарушений в сыворотке крови крыс даёт возможность позиционировать его как потенциальное лекарственное средство с комплексным механизмом действия для профилактики гипоксических нарушений и ускорения адаптации к высотной гипоксии.

Подводя итоги настоящего исследования, мы можем сделать заключение о необходимости использования при ГГ лекарственных средств с комплексным механизмом действия, способных одновременно оказывать действие на разные звенья патогенеза гипоксии.

Вывод

Выявленная эффективность 2-хлорэтокси-­арил-диметил-аминофенилфосфорил-ацето­гидразида и изученный ранее его комплексный механизм действия дают основание рассматривать этот препарат как потенциальное лекарственное средство для профилактики гипоксических нарушений и ускорения адаптации к высотной гипоксии.

 

Участие авторов. И.И.С. — концепция и дизайн исследования, написание текста; А.З.Б. — общий анализ полученных данных, обзор литературы; Е.В.Ш. — проведение экспериментов, обработка полученных результатов; Н.А.Т. — анализ полученных данных в части биохимических исследований; Д.О.Н. — представление полученных результатов в виде таблиц и рисунков, список литературы; Е.В.Б. — проведение биохимических экспериментов; А.Г.О. — обработка и анализ полученных результатов в части исследования перекисного окисления липидов.
Источник финансирования. Исследования выполнены в рамах государственного задания МЗ РФ «Соединения на основе четырёхкоординированного атома фосфора — оптимальная платформа для создания лекарственных препаратов с комплексным механизмом действия для лечения когнитивных нарушений» (2021–2023).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной ­статье.

Об авторах

Ирина Ивановна Сёмина

Казанский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: seminai@mail.ru
Россия, г. Казань, Россия

Африда Загитовна Байчурина

Казанский государственный медицинский университет

Email: seminai@mail.ru
Россия, г. Казань, Россия

Елена Владимировна Шиловская

Казанский государственный медицинский университет

Email: seminai@mail.ru
Россия, г. Казань, Россия

Надия Анверовна Тихонова

Госпиталь для ветеранов войн

Email: seminai@mail.ru
Россия, г. Казани, Россия

Дмитрий Олегович Никитин

Казанский государственный медицинский университет

Email: seminai@mail.ru
Россия, г. Казань, Россия

Екатерина Владимировна Бегичева

Республиканская клиническая больница

Email: seminai@mail.ru
Россия, г. Казань, Россия

Амина Гаязовна Овчинникова

Казанский государственный медицинский университет

Email: seminai@mail.ru
Россия, г. Казань, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы