Accelerated method of laboratory diagnosis of colienteritis

Abstract

The method of bacteriological diagnosis of colienteritis is quite lengthy and painstaking. A positive test result can be obtained no later than the fourth day. In addition, when viewing 8-10 colonies from Endo's medium by an approximate agglutination reaction on glass with specific sera, you can skip exactly the colony that will give a positive reaction. Therefore, the development and application of accelerated methods of laboratory diagnosis of colienteritis is very relevant for the timely implementation of anti-epidemic measures and the correct etiopathogenetic treatment of patients.

Full Text

Метод бактериологической диагностики колиэнтерита довольно длителен и кропотлив. Положительный результат исследования может быть получен не рацее четвертого дня. Кроме того, при просмотре 8—10 колоний со среды Эндо путем ориентировочной реакции агглютинации на стекле со специфическими сыворотками можно пропустить именно ту колонию, которая даст положительную реакцию. Поэтому вопрос разработки и применения ускоренных методов лабораторной диагностики колиэнтерита является весьма актуальным для своевременного проведения противоэпидемических мер и правильного этиопатогенетического лечения больных.

В этом отношении представляют интерес работы зарубежных исследователей, изучавших возможность применения питательных сред с солями тетразолия (трифе- нилтетразолиумхлорид, сокращенно TTC) для быстрого обнаружения кишечной палочки в воде, молоке, молочных продуктах (Вундт, Шонберг, Краус, Сеньерен и Меньен и др.). Была использована высокая устойчивость кишечной палочки к бактерицидному действию TTC и способность восстанавливать его из растворимого и бесцветного состояния до нерастворимого и окрашенного в вишнево-красный цвет фе- нилформазана. В 1956 г. Краус применил этот метод для быстрого обнаружения патогенных кишечных палочек у детей с острыми кишечными заболеваниями путем посева испражнений в жидкую среду с добавлением TTC и агглютинирующих коли- сывороток. Автором применялся TTC-бульон, приготовленный по оригинальной прописи Шонберга: говяжье мясо в количестве 500,0, очищенное от жира, сухожилий и соединительной ткани, заливается 1 литром дистиллированной воды и варится 2,5— 3 часа с добавлением 1% пептона и 0,5% хлористого натрия; pH доводят до 6,2— 6,4. После фильтрации бульон стерилизуется текучим паром или под давлением 1,5 атмосферы в течение 30 минут, стерильно добавляется 2% водный раствор TTC в количестве 11 мл на 100 мл бульона. Раствор TTC приготовляется стерильно с pH, близким к нейтральной реакции. Готовая среда разливается по 2 мл в стерильные пробирки. При исследовании испражнений от больных детей в положительном случае через 6 10 часов на дно одной из пробирок выпадает агглютинат, окрашенный в темно-вишневый цвет. Надосадочная жидкость остается прозрачной и светлой. При отрицательной реакции вся среда равномерно мутнеет и окрашивается в розовый или вишневый цвет.

О перспективности этого метода говорят и работы наших отечественных исследователей. По Д. Б. Розенфельду результаты ускоренного метода в 88,3% совпадали с результатами общепринятой методики бактериологического исследования на колиэнтерит. О специфичности и высокой чувствительности метода пишут Я. С Шварцман и В. М. Белинский.

По предложению И. В. Голубевой (Московский ИВС им. Мечникова) нами проведено испытание ускоренного ориентировочного метода диагностики колиэнтерита с применением жидкой среды, содержащей TTC, параллельно с обычным бактериологическим исследованием на колиэнтерит. Предварительно проверена специфичность и чувствительность метода с музейными штаммами различных возбудителей кишечных заболеваний. В дальнейшем исследован материал от больных острыми кишечными и другими заболеваниями детей, находящихся на лечении в трех стационарах города (1-я инфекционная, 7-я и 8-я детские больницы), а также материал от здоровых детей и взрослых. В работе применялась жидкая среда, TTC и типовые агглютинирующие сыворотки, полученные из Московского ИВС им. Мечникова. Агглютинирующие сыворотки применялись в разведении 1:10 Учет результатов реакции производился через 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 24 часа. Реакция ставилась с агглютинирующими сыворотками против кишечных палочек серологических групп ОШ : В4, 055 : В5, 026 : В6, «145» 018, 086 : В7.

Специфичность реакции проверена в опытах с музейными культурами возбудителей дизентерии Флекснера и Зонне, брюшного тифа, салмонелл Бреслау, энтеропатогенных кишечных палочек серологических групп ОШ : В4, 055 : В5, 026 : Вб, «145», 018, 086 : В7. С этой целью в пробирки с готовой средой закапывалась одна капля взвеси суточной агаровой культуры в физиологическом растворе / (густота по оптическому стандарту— 1 млрд, микробных тел в 1 мл) и добавлялось по 3—4 капли вышеперечисленных агглютинирующих сывороток. Ставился также контроль культуры (бульон-ркультура) и контроль сыворотки (бульонъ-сыворотка). Реакция происходит / строго специфично лишь между гомологичными антигенами и антисыворотками (см. табл. 1). В пробирке для контроля культуры отмечалось диффузное помутнение питательной среды с розовым или красным окрашиванием. Контроль сыворотки оставался без изменения.

Для определения чувствительности метода в ряд пробирок с питательной средой вводилась взвесь суточной агаровой культуры энтеропатогенных кишечных палочек в физиологическом растворе поваренной соли в объеме 0,1 мл с содержанием 100, 1000, 10000, 100000, 10 и 100 млн. микробных клеток в 1 мл: Антисыворотки добавлялись по 3—4 капли. С целью контроля из последних двух разведений производился высев на чашки со средой Эндо.

Таблица 1. Испытание специфичности ускоренного метода лабораторной диагностики колиэнтерита с применением жидкой среды, содержащей TTC

Наименование культуры	Антисыворотки						Контроль культ.	Контроль сыворотки
	0-ш	0-55	0-26	145	0-18	0-86
ОШ:В4	#	—	—	—	—	—	—	—
055:В5	—	#	—	—	—	—	—	—
026:В6	—	—	#	—	—	—	—	—
«145»	—	—	—	#	—	—	—	—
018	—	—	—	—	#	—	—	—
086:В7	—	—	—	—	—	+++	—	—
Б.диз.Зонне	—	—	—	—	—	—	—	—
Б.диз.Флекснера	—	—	—	—	—	—	—	—
Салм.Бреслау	—	—	—	—	—	—	—	—
Б.бр.тифа 3111	—	—	—	—	—	—	—	—
Б.бр.тифа 62	—	—	—	—	—	—	—	—

Учет результатов производился после выдерживания в термостате в упомянутые выше часы. Чем меньшее количество микробов засевалось, тем позже появлялся четкий результат и наоборот (см. табл. 2).

При посеве 10 микробных клеток в течение 2—8 часов не было роста бактерий, и среда оставалась прозрачной. При наблюдении через 10 и 12 часов отмечался слабый рост культуры, и лишь через 24 часа можно было видеть темно-красный агглютинат в виде большой точки на дне пробирки, а надосадочная жидкость оставалась светлой и прозрачной. При посеве 100, 1000, 10000 микробных клеток положительный результат на два креста отмечался через 10 часов, на три и четыре креста — через 12 часов. Самое раннее появление положительного результата отмечалось через 6— 8 часов, и на нашем материале мы не могли подтвердить наблюдения Я. С. Шварцман и В. М. Белинского о появлении крупных хлопьев культуры через 2 часа. Во всех пробирках положительный результат оставался четким, без изменения и при наблюдении через 24 часа, что практически облегчает процесс наблюдения и отметку результатов.

Таблица 2. Испытание чувствительности ускоренного метода диагностики колиэнтерита с применением жидкой среды, содержащей TTC

Наименование культуры	Кол-во засеянных клеток	Часы учета							Контр, культуры	Контр, сыворотки
		2	4	6	8	10	12	24
ОШ:В4	100 млн.	—	---	+ +	#	#	#	+ + +	—	—
	10 млн.	—	—	—	#	#	#	#	—	—
	1 млн.	—	—	—	+ +	#	#	#	—	—
	100000	—	—	—	+ +	+ +	#	#	—	—
	10000	—	—	—	±	+ +	#	#	—	—
	1000	—	—	—	±	+ +	+ + +	#	—	—
	100	—	—	—	±	± +	+ + +	#	—	—
	10	—	—	—	±	+	±	#	—	—

Получение отчетливой положительной реакции даже при посеве минимальных количеств микробов подтверждает высокую чувствительность метода и позволяет обнаружить энтеропатогенные кишечные палочки в поздние сроки заболевания, когда выделение возбудителя, как известно, в количественном отношении значительно меньше по сравнению с острым периодом болезни.

Учитывая достаточную специфичность и высокую чувствительность метода, мы применили его для исследования испражнений от 169 человек: 129 детей с острыми кишечными заболеваниями (острая дизентерия, диспепсия и др.), 15 детей с пневмонией и бронхопневмонией без расстройства кишечника, 15 здоровых детей и 10 взрослых. Большинство обследованных детей было в возрасте до одного года. Забор материала производился трубочками Цимана или с пеленок и горшочков во флакончики с физиологическим раствором. Взвесь испражнений хорошо встряхивалась и ставилась на 10—15 минут для, отстаивания. В питательную среду вводилось по 1—2 капли надосадочного слоя взвеси, по 3—4 капли типовых коли-сывороток. Учет результатов производился в те же часы. Всего произведено 209 анализов, положительный результат по общепринятой методике получен у 15 человек, по ускоренной — у 22. Совпадение результатов по обоим методам получено в 92,7% (см. таблицу 3).

Таблица 3.Сравнение результатов обычного бактериологического и ускоренного метода лабораторной диагностики колиэнтерита

Количество анализов	Результат реакции по ускоренному методу	+	-	+	-	нет роста
	Результат реакции по общепринятому методу	+	-	-	+	-
Абсолютное число		14	180	8	3	4
Процент от общего числа		6,6	86,1	3,9	1,5	1,9
Процент совпадений и несовпадений		92,7		7,3
Всего анализов		209

Выводы

1.Проверка ускоренного метода лабораторной диагностики колиэнтерита с применением жидкой среды, содержащей трифенилтетразолиумхлорид (TTC), показала достаточную специфичность и высокую чувствительность его. При исследовании испражнений от больных острыми кишечными и другими заболеваниями детей, от здоровых детей и взрослых совпадение результатов по ускоренному и обычному бактериологическому методу лабораторной диагностики колиэнтерита получено в 92,7%.

2.Несмотря на некоторые недостатки (положительная реакция в результате взаимодействия живой культуры и специфической сыворотки, необходимость применения дефицитного реактива), метод может быть рекомендован как дополнительный и ориентировочный при исследованиях на колиэнтерит.