Biology of the tubercle bacillus

Abstract

Long before the discovery of the pathogen tbc, botanists used a double color: they stained their preparations with an alkaline or alcoholic solution of methylene blue, and then again with an aqueous solution of Vesuvine. He was also aware of the fact that sometimes, with such a double stain, some parts of the preparation from the plant parenchyma lose their blue color and are colored in the color of Vesuvine.

Full Text

(С рис.).

I.

Еще задолго до открытия возбудителя tbc ботаники ¹) применяли двойную окраску: они окрашивали свои препараты щелочным или спиртовым раствором метиленовой синьки, а затем вторично водным раствором везувина. Им же был известен и тот факт, что иногда при такой двойной окраске некоторые части препарата из растительной паренхимы теряют синюю окраску и окрашиваются в цвет везувина.

R. Koch, применяя эту двойную окраску по отношению ко всем известным в то время микроорганизмам, убедился, что все они при вторичном окрашивании водным раствором везувина теряют синюю окраску и принимают окраску последнего. Окрашивая же подобным способом различные продукты tbc больных, он убедился, что весь препарат окрашивается в коричневый цвет от везувина, и что на этом коричневом фоне, встречается микроорганизм палочковидной формы, который упорно сохраняет свою синюю окраску от метиленовой синьки. Пробуя прививать материал, в котором этот микроорганизм встречался, морским свинкам ¹) и вызывая у них tbc, а с другой стороны получая отрицательный результат при прививке опытным животным продуктов tbc больных, в которых этот микроорганизм отсутствовал, Koch естественно пришел к выводу, пока предположительному, что этот микроорганизм и есть возбудитель tbc.

Эта двойная окраска, давшая Koch’у возможность придти к столь важному выводу, как известно, послужила ему в дальнейшем доказательством одного пункта его известной триады. Надлежало затем выполнить второй пункт триады — получить чистую культуру этого микроорганизма. Эта задача была самой трудной, ибо микроорганизм этот не развивался на обычных питательных средах, и получить его в чистой культуре Koch’у не удавалось до тех пор, пока он не применил, в качестве питательной среды, свернутой кровяной сыворотки теленка. Но и на этой среде рост получался медленный и скудный.

Насколько получение первой генерации tbc палочки по методу Koch’а трудно, видно, напр., из того, что слишком через 40 лет д-р Цехновицер ²) писал, что ему ни разу не удалось получить жизнеспособной культуры tbc по методу Koch’а: причину неудачи он усматривал в "неовладении необходимой техникой".

После знаменитого сообщения Kocha’а, сделанного в 1882 г., во многих местах, однако, все же были получены по его методу чистые культуры возбудителя tbc.

Проф. Roux ³) решил, что данный возбудитель должен рости на агаре. Все его попытки в этом направлении окончились, однако, неудачно. Раздумывая над причиной неудач, Roux сделал предположение, что палочки не развиваются потому, что агар вследствие долгого стояния в термостате, в виду медленного роста возбудителя, слишком высыхает и потому становится негодной питательной средой. Чтобы воспрепятствовать этому высыханию, он решил прибавить к нему какое-либо гигроскопическое вещество и прибавил глицерин. Неожиданно рост палочек получился при этом быстрый и обильный. С тех пор прибавление глицерина стало conditio sine qua non для выращивания tbc палочек. Прибавка эта сделала возможным выращивание палочек на различнейших питательных средах: агаре, бульоне, жидкой желатине, картофеле, моркови, репе, брюкве, отваре пивных дрожжей, макаронах, минеральных средах ит. д. Благодаря ей некоторым авторам удалось получить в 50% первую генерацию сразу на агаре.

Deucke ⁵) вообще сомневается в возможности выращивания tbc бацилл на средах без глицерина и пишет, что "согласно полученным до сих пор результатам следует с осторожностью относиться к сообщениям о росте tbc бацилл на питательных средах, лишенных глицерина, ибо не подлежит сомнению, что сильная потребность в глицерине находится в связи с сильным содержанием жира в tbc палочках, особенно нейтрального жира, т. е. глицерида жирных кислот". Вследствие подобного толкования причины необходимости глицерина со стороны столь авторитетного ученого вопрос о выращивании палочек tbc на безглицеринных средах есть не только вопрос человеческой настойчивости, но имеет некоторый raison d’etre. Как известно, причину безуспешного применения данных микробов для целей иммунизации некоторые склонны видеть в их кислотоупорности. Так как, какова-бы ни была причина последней, богатству жиром можно приписывать известную роль в ней, то отсюда естественно желание получить культуру tbc с наименьшим содержанием жира, желание выращивать tbc палочку на средах с наименьшей возможностью его продукции, т. е. на средах без глицерина. Такие попытки и были сделаны многими, но невсегда удачно. Так, проф. Яновский ⁶) на основании работ Armand-Delille’я, Mayer’а, Schöffer’а и Terroine’а отмечает, что глицерин безусловно необходим, хотя его содержание может быть всего 0,8%. Другие получили в этом отношении положительный результат. Так, самому R. Koch’у ⁷) удалось получить культуру палочек на нейтральном бульоне без глицерина в виде осадка на дне колбы, при известных условиях опыта (толщина слоя жидкости не более 1 см. и частое взбалтывание среды). Гомогенная культура Ferran’а тоже развивалась на обыкновенном бульоне. В самое последнее время об успешном выращивании tbc палочек на обыкновенном бульоне сообщают Любарский и Тогунова ⁸).

Нам удалось также получить культуру tbc, которая успешно развивалась на обыкновенном бульоне, в процессе разработки другого вопроса, сущность которого сводится к следующему:

Как известно, если смешать эмульсию из tbc палочек с эмульсией из лейкоцитов, или же впрыснуть такую же эмульсию в кровь, то микробы быстро захватываются полинуклеарами. Но в них микробы не погибают, а, застрявши на местах оседания лейкоцитов (преимущественно в лимфатических щелях легкого), начинают размножаться, причем полинуклеары гибнут, от них не остается и следа. Отчего, спрашивается, гибнут полинуклеары? Вероятно, вследствие гибельного действия на них эндотоксина или токсина туберкулезных палочек. Но о первом здесь не может быть и речи, так как эндотоксины — это субстанции, освобождающиеся только после гибели и распада бактерий, а мы видели, что палочки остаются нетронутыми и способными к дальнейшему размножению. Следовательно, здесь может идти речь лишь о каком-то токсине. Мы задались целью сделать попытку получить культуру tbc, в которой это ядовитое вещество было-бы уничтожено или доведено до минимума.

Так как протоплазматические яды (карболовая к-та, хлороформ) мало влияют на токсины вообще, и последние, наоборот, очень чувствительны к алкоголю ("Alkohol ist sehr schädlich" ⁹), то мы решили попробовать, не удастся-ли вырастить культуру tbc на среде без глицерина, с заменой его этиловым алкоголем, чтобы убедиться, каковы будут свойства этой культуры. Такого рода замена не должна казаться странной, так как в таблице углеродистых соединений, обладающих питательными свойствами (Nägeli), этиловый алкоголь числится, и не на последнем месте, а то, что глицерин, как источник углекислоты, не представляется специфическим веществом для tbc палочек и может быть заменен вообще (глюкозой, сахарозой, лактозой, гликогеном, декстрином), — это установлено твердо.

Мы приготовили 5 колбочек с различным содержанием глицерина и спирта по следующей схеме:

A	47,5	к. с.	бульона	+2,0	глицерина	+ 0,75	к.с.	этилового	спирта
B	47,0	„	„	+1,5	„	+ 1,5	„	„	„
C	46,75	„	„	+1,0	„	+ 2,25	„	„	„
D	46,5	„	„	+0,5	„	+ 3,0	„	„	„
E	47,0	„	„	+ 0	„	+ 3,0	„	„	„

и делали пересевы, по мере вырастания культуры, из одной колбочки в другую, с поверхности на поверхность среды. При этом между D и E нам пришлось вставлять еще промежуточные звенья, а иногда делать пересев на бульон одного и того же состава 2—3 раза. К концу года мы получили рост и на E. Месячная культура имела вид очень тонкой и рыхлой пленки. При пересеве из Е на обыкновенной бульон или агар (без глицерина) рост наблюдал и здесь, вначале скудный, с последующими пересевами — более быстрый и обильный. Палочки сохраняли при этом свою кислотоупорность и внешний вид.

II.

Как известно, tbc бациллы развиваются не только на питательных средах животного и растительного происхождения, но и на минеральных средах. В свое время такие среды были предложены Ушинским, Fraenkel’ем, Koch’ом, Proskauer’ом и Beck’ом и др. При этом, если на питательных средах неминеральных некоторым, как мы видели, удалось получить рост tbc палочек и без добавления к этим средам глицерина, то на минеральной среде без глицерина получить рост tbc палочек пока, кажется, не удалось никому. В состав этих сред поэтому обязательно должен входить глицерин. Среда Proskauer’а и Beck’а имеет, напр., следующий состав: углекислого аммония 0,35, фосфорнокислого калия 0,15, сернокислой магнезии 0,2, глицерина 1,5, воды 100,0. По составу этой среды видно, что углерод может быть заимствован в ней tbc палочкой или из глицерина, или из углекислого аммония.

Мы изменили немного состав этой среды, заменив углекислый аммоний хлористым аммонием и увеличив количества фосфорнокислого калия и глицерина. Среда тогда имеет такой состав: хлористого аммония 0,35, фосфорнокислого калия 0,5, сернокислой магнезии 0,2, глицерина 3,0,. воды 190,0.

На этой среде мы часто получали обильные культуры tbc палочек. Готовится среда просто: все составные части растворяются при комнатной t°, затем среда разливается по пробиркам и колбочкам и стерилизуется в автоклаве при 120° влечении 15—20 минут. Среда при этом остается прозрачной.

Рассматривая состав этой среды, мы видим, что единственным органическим веществом, единственным источником углерода здесь является глицерин. Без глицерина на этой среде роста не получается. Очевидно, тот штамм tbc палочек, который мы приучили к росту на обыкновенном бульоне без глицерина, черпает себе углерод для своих построений из органических веществ самого бульона. Тогда возникает вопрос: будет-ли этот штамм рости на упомянутой минеральной среде (для краткости обозначим ее буквой «K»), если к ней вместо глицерина будет прибавлен бульон — в качестве источника углеродистых соединений? Оказывается, что да. Мы прибавляли к среде К бульон в количестве 50%, 40%, 30%, 10%, 8%, 6%, 4%, 3%, 2%, 1,5%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7% 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3% и т.д. На каждом разведении мы выращивали обыкновенно 5—10 генераций. Наконец мы могли получить рост на среде К и с 0% содержанием бульона. Рост получается при этом как на дне, так и на поверхности среды (в зависимости от способа посева). В первом случае при покатывании пробирки между ладонями видно, как со дна винтообразно всплывает белый осадок в виде песка. Во втором случае мы имели на поверхности среды тоненькую пленочку в виде холестериновою налета, которая далеко поднимается по стенке пробирки.

Мы выращивали при тех же условиях и культуру брюшного тифа. Здесь условия лучшие: брюшнотифозная палочка ростет и развивается быстро (через сутки) на простом бульоне. Мы применили по отношению к ней тот же метод разведений и количество пересевов, как и относительно tbc палочки. Рост получился в виде сплошного помутнения среды. Вначале получалось много инволюционных форм: длинные ветвящиеся нити, палочки, обнаруживающие резкое биполярное расположение протоплазмы при окраске фуксином, и т. д. В дальнейшем, по мере привыкания к среде, инволюционные формы почти исчезали. На некоторых разведениях приходилось делать большее число пересевов, так как иногда после 10 генераций культура на более низких разведениях не развивалась. Мы дошли до содержания в среде К 0,25% бульона. К сожалению, штамм этот погиб во время каникул.

Между прочим здесь нужно иметь в виду одну деталь: когда мы доходили до содержания 2%—1% бульона в среде К, последняя через24—48 часов после посева оставалась как будто стерильной — прозрачной. Но это явление кажущееся, ибо стоило поместить позади пробирки зажженную электрическую лампочку и встряхнуть пробирку, чтобы увидеть, как сплошное помутнение расходится в виде облачка.

Таким образом из изложенного явствует, что нам удалось получить вполне жизнеспособную tbc культуру (до настоящего времени нами получено 17 генераций), которая развивается на безуглеродистой среде. Теперь возникает вопрос: откуда же tbc палочки черпают углерод для своих построений? Единственный ответ: из углекислоты воздуха. Но для того, чтобы подтвердить справедливость такого заключения, нужно еще доказать, как справедливо заметил нам проф. В. М. Аристовский, что при отсутствии углекислоты воздуха культура развиваться не будет; это послужит и доказательством того, что в применяемых минеральных веществах нет следов органических веществ, достаточных для жизни и размножения tbc палочек. Для доказательства этого ставится следующий опыт:

3 промывные склянки А, В и С (см. рис.), наполовину наполненные 30% раствором едкого калия, соединены при помощи резиновой трубки a, снабженной зажимом b, со стеклянной трубной c, проходящей через резиновую пробку a колбы Д, емкостью в 3 литра. Через ту же пробку проходит стеклянная трубка е, которая соединена, при помощи резиновой трубки f, снабженной зажимом g, со стеклянной трубкой h, проходящей через пробку бутыли Е, емкостью в 10 литров. Колба Д наполнена вся водой, бутыль Е — на три четверти. Изогнутая трубка k, предварительно наполненная водой и запирающаяся зажимом е, служит сифоном. При открывании зажима е вода медленно вытекает из бутыли Е через трубку k, и взамен ее в бутыль присасывается вода из колбы Д, а взамен этой последней в колбу Д протягивается воздух, проходящий предварительно через промывные склянки. Когда вода наполовину вытечет из колбы Д, мы закрываем зажим l, чем прекращается действие сифона. Тогда мы вынимаем из колбы Д резиновую пробку и опускаем туда 2 пробирки на нитках: одну пробирку со средой k с посевом, другую — с прозрачной известковой водой, после чего закрываем пробкой колбу и опять открываем зажим l. Вода из колбы Д медленно переходит в бутыль Е. После того, как вся вода из колбы Д вытечет, на место вытекающей воды из бутыли Е туда будет присасываться воздух из колбы Д, который в свою очередь заменится воздухом, проходящим через склянки А, В и С. Пробка d колбы Д и отверстия в ней, через которые проходят трубки с и е, заливаются параффином. После того, как почти вся вода вытечет из бутыли Е, зажимы b и g закрываются, резиновые трубки снимаются с трубок х и h, и колба ставится в термостат. Через стенку ее видно, что известковая вода не мутнеет, и это свидетельствует о том, что в колбе Д воздух не содержит CO₂. Контрольная пробирка с посевом ставится в колбе, закрытой резиновой пробкой, рядом в термостат. Каждые 24—36 часов колба Д соединяется с промывными склянками и бутылью Е, наполненной водой, вода выпускается из бутыли и замещается воздухом, проходящим из колбы Д, которая в свою очередь заполняется воздухом, проходящим через промывные склянки. Таким образом обновляется в колбе Д воздух. Известковая вода в пробирке не мутнеет. В контрольной колбе резиновая пробка каждый раз вынимается на такое же время, тоже для обновления состава воздуха. Через, 12—14 дней колба открывается, и тогда можно убедиться, что в то время, как в контрольной пробирке поверхность среды покрыта тонкой пленкой в виде холестеринового налета, которая поднимается по стенке пробирки, в опытной пробирке на поверхности роста нет (при условии посева на поверхность среды). В известковой воде образуется иногда на поверхности белый тонкий налет, вся же вода прозрачна. При встряхивании на воздухе она мутнеет. Под микроскопом в мазке из пленки мы видим, что имеем дело с чистой культурой кислотоупорных палочек tbc.

Из этого опыта видно, что наша культура tbc палочек усваивает углерод из углекислоты воздуха. При этом создается впечатление, что здесь имеет место нарушение основного биологического закона — закона сохранения энергии. Возникает именно вопрос, из какого источника tbc палочки получают энергию, необходимую для диссоциации CO₂? Для зеленых растений этим источником служит солнце или, точнее, тепло от поглощенного света, но ведь наша культура развивается в темноте и, следовательно, этот источник отсутствует.

Для того, чтобы ответить на этот вопрос, надо иметь в виду следующее ¹⁰): органическое вещество характеризуется 2-мя свойствами — наличием углерода и способностью гореть. Но есть вещества минеральные, обладающие способностью гореть, т. е. освобождать свободную теплоту, не содержа при этом углерода; к таким веществам относятся аммиак, сероводород и др. В нашей среде К аммиак как раз и содержится. Вероятно, он-то и служит таким источником энергии.

Таким образом на основании наших опытов мы приходим к выводу, что, при известных условиях, tbc палочки могут заимствовать углерод непосредственно из углекислоты воздуха.