Studying of biofilm formation by clinical strains of Candida albicans in interaction with Fusarium solani to predict the severity of atopic dermatitis

Cover Page

Abstract


Aim. To assess the ability to form biofilms by clinical strains of the yeast Candida albicans isolated from patients with atopic dermatitis in exacerbation and remission stages under the effect of Fusarium solani micromycete and its absence.

Methods. The study included 70 strains of C. albicans and one strain of F. solani. Fungal biofilms formed accor­ding to the method of Ramage. The optical density of the biofilms measured using a micro plate reader at 620 nm. The effect of associated fungi on the biofilm-forming properties of C. albicans strains was studied by an extract from opportunistic F. solani fungi.

Results. The greatest biofilm formation was observed in strains isolated at the remission stage. The strains isolated in the acute period were inferior to them in the ability to form biofilms (average values of film formation were 0.143 and 0.087, respectively). Co-cultivation of C. albicans strains with F. solani fungus extract stimulated biofilm formation of C. albicans strains at a concentration of 1:10.

Conclusion. This study showed a possible synergism between C. albicans and F. solani in polymicrobial skin infections, because the products of the fungus F. solani increase one of the virulence factors of the fungus C. albicans; the possibility to assess of a stimulating effect of associated fungi on the virulence one of an agent of infectious disease process will allow predicting the disease severity.


Full Text

Актуальность. В последнее время, особенно в индустриально развитых государствах, атопический дерматит — лидирующая кожная патология. Среди аллергических заболеваний удельный вес атопического дерматита достигает более 60% [1]. Сопровождается данное заболевание длительным воспалительным процессом на коже, развитие которого связано с комплексным процессом. Морфологические изменения кожного покрова при этом способствуют колонизации на коже бактериальной и грибковой микробиоты, которая может приводить к развитию инфекционных осложнений. Так, микроскопические грибы, часто обнаруживаемые у иммунокомпрометированных пациентов, усугубляют тяжесть течения атопического дерматита за счёт индукции аллерген-специфических иммуноглобулинов E, развития сенсибилизации и т.д. [1, 2].

У многих пациентов с атопическим дерматитом, особенно при длительном течении заболевания, в микробиологических посевах встречаются грибы, относящиеся к различным группам. Результаты обследования пациентов, обратившихся в лабораторию микологии Казанского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии (КНИИЭМ), показывают, что дрожжеподобные грибы бывают одними из наиболее часто обнаруживаемых представителей микробиоценоза кожи. Частота обнаружения грибов Candida albicans в организме человека за период с 2017 по 2019 гг. составила, по данным наших исследований, около 64%. В 45% случаев совместно с C. albicans выделяли и различные виды мицелиальных грибов. Так, наряду с дерматомицетами (Trichophyton spp.) высевались и плесневые грибы (Aspergillus spp., Fusarium spp., Alternaria spp., Rhizopus spp., Penicillium spp. и т.д.). Причём наиболее часто такую картину наблюдали на фоне длительного поражения кожи [3].

В литературе появляется всё больше сообщений о том, что огромную роль в патогенезе микотических осложнений играют факторы патогенности самих грибов. Более 65% всех инфекционных заболеваний обусловлено микроорганизмами, существующими в форме биоплёнок (высокоупорядоченных сообществ микроорганизмов внутри образованного ими полисахаридного матрикса) [4]. Известно, что грибы C. albicans — главные грибковые агенты, способные образовывать биоплёнки [5–7]. Это клинически значимая способность, поскольку повышается устойчивость клеток микроорганизмов к традиционным противогрибковым препаратам. Биоплёнки могут противостоять иммунным защитным механизмам хозяина.

Цель. В связи с этим целью нашей работы было определение способности к формированию биоплёнок клиническими штаммами дрожжевых грибов C. albicans, выделенных от больных хроническим рецидивирующим атопическим дерматитом в стадиях обострения и ремиссии, и влияния метаболитов микромицетов Fusarium solani на процесс биоплёнкообразования.

Материал и методы исследования. Объек­тами исследования служили штаммы C. albi­cans (n=70) и F. solani (n=1), выделенные с поверхности кожи пациентов с клиническими признаками поверхностной микотической инфекции, находящихся на амбулаторном лечении, с хроническим рецидивирующим течением в стадиях обострения и ремиссии. В исследование были включены пациенты c хроническим рецидивирующим атопическим дерматитом, проходившие амбулаторное лечение у дерматолога. Диагноз «атопический дерматит» был поставлен на основании критериев, указанных в Федеральных клинических рекомендациях по дерматовенерологии 2015 г. [8]. Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФБУН КНИИЭМ Роспотребнадзора (протокол №2 от 09.09.2019).

Материал для исследования брали с помощью стерильного ватного тампона с последующим смывом дистиллированной водой по периметру наиболее свежих поражений. Затем тампон помещали в стерильную пробирку с 2 мл дистиллированной водой. Посев смыва проводили на агаризованную среду Сабуро в две чашки Петри, причём в одну чашку добавляли ципрофлоксацин в количестве 50 ЕД/мл среды. Производили расчёт численности клеток грибов в смыве с 1 тампона в 1 мл дистиллированной воды. Культуры грибов выращивали на среде Сабуро при температуре 30 °С в течение 2–5 сут (для дрожжевых и мицелиальных форм соответственно) [9].

Идентификацию грибов проводили общепринятыми микроскопическими и биохимическими методами. В работе использовали селективные хромогенные среды CandiSelect 4 (Bio-Rad) и коммерческие тест-системы, основанные на исследовании ауксанограммы Auxacolor 2 (Bio-Rad).

Формирование биоплёнок грибов проводили по методу Ramage и соавт. [10]. Культуру грибов засевали в жидкую среду Сабуро и инкубировали в орбитальном шейкере (180 об./мин.) при 30 °С в течение 1 сут. Затем культуру осаждали центрифугированием при 3000 об./мин в течение 3 мин, промывали 2 раза стерильным фосфатным буфером и ресуспендировали в жидкой среде Сабуро с конечной плотностью 1,0×106 клеток/мл. Суспензию клеток в количестве 100 мкл вносили в 96-луночные плоскодонные полистироловые микропанели и инкубировали в течение 2 сут при 37 °С. ­После образования биоплёнки планшеты промывали 3 раза стерильным фосфатным буфером. Степень или количество формирования биоплёнок оценивали колориметрическим способом. В лунки со сформированными биоплёнками добавляли 125 мкл водного раствора 1% кристаллического фиолетового и инкубировали 20 мин при 37 °С. После удаления избытка красителя и промывки лунок добавляли 95% этанол в количестве 125 мкл, оптическую плотность (D) регистрировали на ридере с вертикальным лучом света с использованием светофильтра 620 нм [6].

Для изучения влияния грибов-ассоциантов на биоплёнкообразующие свойства штаммов C. albicans в работе использовали экстракт из условно-патогенных грибов F. solani, полученный по методу, разработанному лабораторией микологией КНИИЭМ в соответствии стандартам ВФС 42-93-88. Культуру грибов выращивали на жидкой среде Сабуро в течение 5–7 сут при температуре 30 °С. Затем мицелий отделяли от культуральной жидкости и растирали в ступке до однородной массы. После этого измельчённый мицелий смешивали с культуральной жидкостью и фильтровали через асбестовые фильтры. Ингибирующее или стимулирующее действие исследовали (оценивали) методом острого опыта [11]. Культуру клеток C. albicans засевали в жидкую питательную среду Сабуро (150 мкл), разлитую в 96-луночные плоскодонные полистироловые микропанели, в которые также вносили 15, 30 или 60 мкл соответствующего экстракта. Посевы культивировали в течение 48 ч при температуре 37 °С. Затем определяли уровень биоплёнкообразования, как описано выше. В качестве контроля исследовали культуру клеток C. albicans, выросшую без добавления экстрактов.

Статистический анализ обработки результатов проводили с помощью программы Bio­stat 4.03, вычисляли среднюю арифметическую величину (M) и ошибку средней арифметической (m). Достоверность различий определяли с помощью доверительного коэффициента Стьюдента (t), различия рассматривали как достоверные при p <0,05.

Результаты и обсуждение. Анализ биоплёнкообразования грибами C. albicans проводили на сформированных двух группах штаммов:
1) выделенные от больных в острый период, где количество грибов в микробиологическом посеве превышало 103 КОЕ/мл1;
2) выделенные от больных с хроническим рецидивирующим течением в стадии ремиссии, в отсутствие ярко выраженных клинических признаков грибкового поражения, количество грибов в микробиологическом посеве не превышало 102 КОЕ/мл.

В ходе исследования установлена способность всех штаммов грибов C. albicans формировать биоплёнку. Эффективность биоплёнкообразования клинических штаммов грибов C. albicans оценивали по оптической плотности, диапазон значений которой варьировал от 0,046 до 0,326 ед. Наибольшее биоплёнкообразование отмечено у штаммов, выделенных в хроническую фазу заболевания, в то время как штаммы, выделенные в острый период, существенно (в 1,5 раза) уступали им в способности формировать биоплёнки. Средние значения плёнкообразования составили 0,143 и 0,087 ед. соответственно (табл. 1). При этом максимальные значения биоплёнкообразования у штаммов, выделенных в хроническую фазу заболевания, достигали значений оптической плотности 0,326 ед., тогда как у штаммов в острый период — 0,112 ед.

 

Таблица 1. Биоплёнкообразование клинических штаммов C. albicans, выделенных у пациентов с атопическим ­дерматитом с хроническим рецидивирующим течением в стадиях обострения и ремиссии

Локализация штамма

Штаммы C. albicans, выделенные
в стадии обострения

Штаммы C. albicans, выделенные
в стадии ремиссии

n

Количество сформированной биоплёнки (М±m)

n

Количество сформированной биоплёнки (М±m)

Поверхность гладкой кожи

35

0,087±0,01 (0,046–0,112)

35

0,143±0,031 (0,1–0,326)

Примечание. Даны значения D620 (за вычетом фона) поглощения красителя в лунках микропанели. Различия значений между группами штаммов C. albicans, выделенных в стадии обострения и ремиссии, достоверны, p <0,05 (p=0,039).

 

Низкие значения биоплёнкообразования штаммов, выделенных в острый период, вероятно, обусловлены воздействием внешних условий, которое оказывает возможное влияние на индукцию ряда других факторов патогенности: комплекс внеклеточных протеолитических ферментов, обладающих способностью разрушать белки кожных покровов и обеспечивающих пенетрацию в ткани макроорганизма, гифообразование и т.д. [12]. Однако следует отметить, что и в группе штаммов, выделенных в хроническую фазу заболевания, у 5 штаммов отмечены низкие значения биоплёнкообразования, что может свидетельствовать о возможных начавшихся морфологических изменениях клеток от дрожжеподобных форм к гифам, что обеспечивает инвазию (распространение) возбудителя в ткани и, как следствие, обострение инфекционного процесса.

Совместное культивирование штаммов C. albicans с экстрактом гриба F. solani выявило наличие стимулирующего действия на биоплёнкообразующие свойства штаммов C. albicans. Эффект достигался только при культивировании штаммов с минимальным объёмом экстракта 15 мкл, плотность биоплёнки увеличивалась в 1,5 раза по сравнению с биоплёнкой, сформированной в отсутствие экстракта (рис. 1). Добавление 60 мкл экстракта оказывало выраженное ингибирующее действие на рост штаммов C. albicans. Однако внесение 30 мкл экстракта при культивировании грибов приводило к активации формирования у клеток C. albicans трубок прорастания (гифообразование). Таким образом, стимулирующее действие экстракта гриба F. solani на биоплёнкообразующие свойства штаммов C. albicans наблюдали при совместном культивировании в соотношении 1:10.

 

Рис. 1. Оптическая плотность биоплёнок, сформированных грибами Candida albicans при совместном культивировании с экстрактом гриба Fusarium solani в различных объёмах

 

В клинической практике следует помнить о том, что низкий уровень обсеменённости организма грибами при хронических формах заболевания может свидетельствовать о развитии биоплёночной структуры — одной из основных стратегий выживания микроорганизма в организме человека. Изучение особенностей формирования микробных ассоциаций, а также взаимного влияния микроорганизмов в ассоциациях позволит прогнозировать развитие инфекционного процесса.

Выводы

1. Существует корреляция между биоплёнкообразованием штаммов и течением кожного микотического заболевания.

2. Высокая степень плёнкообразования характерна для штаммов, выделенных от больных с хроническим рецидивирующим течением в стадии ремиссии заболевания.

3. Возможен синергизм C. albicans и F. solani при грибковых инфекциях кожи. Показана возможность увеличения одного из факторов патогенности гриба C. albicans под влиянием продуктов жизнедеятельности гриба F. solani.

 

Участие авторов. С.А.Л. и Р.И.В. проводили исследования; А.А.Ш., Е.В.Ф. и И.М.Х. отвечали за подбор групп пациентов и анализ результатов; Е.В.Х. и Г.Ш.И. отвечали за сбор и анализ результатов, С.А.Л. — руководитель работы.

Источник финансирования. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ №20-04-00247.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

About the authors

S A Lisovskaya

Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology; Kazan State Medical University

Author for correspondence.
Email: S_Lisovskaya@mail.ru
SPIN-code: 4167-4280
ResearcherId: S-4146-2018

Russian Federation, Kazan, Russia; Kazan, Russia

R I Valieva

Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology; Kazan State Medical University

Email: S_Lisovskaya@mail.ru
SPIN-code: 4514-5847

Russian Federation, Kazan, Russia; Kazan, Russia

A A Sharifullina

Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology; Kazan (Volga Region) Federal University

Email: S_Lisovskaya@mail.ru

Russian Federation, Kazan, Russia; Kazan, Russia

E V Fayzullina

Kazan State Medical University

Email: S_Lisovskaya@mail.ru
SPIN-code: 7939-1532

Russian Federation, Kazan, Russia

I M Khismatullina

Kazan State Medical University

Email: S_Lisovskaya@mail.ru

Russian Federation, Kazan, Russia

E V Khaldeeva

Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: S_Lisovskaya@mail.ru
SPIN-code: 8942-7490

Russian Federation, Kazan, Russia

G Sh Isaeva

Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology; Kazan State Medical University

Email: S_Lisovskaya@mail.ru
SPIN-code: 8251-9884

Russian Federation, Kazan, Russia; Kazan, Russia

References

  1. Gurbanova M.G., Gulordava M.D., Chilina G.A. et al. Clinical peculiarities of atopic dermatitis complicated by skin mycoses. Problemy meditsinskoy mikologii. 2012; 14 (4): 43–46. (In Russ.)
  2. Glatz M., Bosshard P., Schmid-Grendelmeier P. The role of fungi in atopic dermatitis. Immunol. Allergy Clin. North Am. 2017; 37 (1): 63–74. doi: 10.1016/j.iac.2016.08.012.
  3. Fayzullina E.V., Khismatulina I.M., Lisovskaya S.A., Gordeeva A.M. Mo­dern features of the course of acne: the results of own researches. Problemy meditsinskoy mikologii. 2019; 21 (3): 35–38. (In Russ.)
  4. Golub A.V. Bacterial biofilms — a new therapeutic target? Clinical Microbiology and Antimic­robial Chemotherapy. 2012; 14 (1): 23–29. (In Russ.)
  5. Costa-Orlandi C.B., Sardi J.C.O., Pitangui N.S. et al. Fungal biofilms and polymicrobial diseases. J. Fungi (­Basel). 2017; 3 (2): 22. doi: 10.3390/jof3020022.
  6. Nikitina L.E., Lisovskaya S.А., Startseva V.A. et al. Development of novel effective agents against Candida albicans biofilms. BioNanoScience. 2019; 9: 539–544. doi: 10.1007/s12668-019-00648-6.
  7. Lisovskaya S.A., Khaldeeva E.V., Glushko N.I., Parshakov V.R. Evaluation of biofilm formation ability of clinical strains of Candida albicans isolated at the acute and chronic forms of candidosis of the skin and mucous membranes. Problemy meditsinskoy mikologii. 2017; 19 (1): 31–33. (In Russ.)
  8. Federal'nye klinicheskie rekomendatsii. Dermatovenerologiya 2015. Bolezni kozhi. Infektsii, peredavaemye polovym putem. (Federal clinical guidelines. Dermatovenerology 2015. Diseases of the skin. Sexually transmitted infections.) Ed. 5th ed. M.: Business Express. 2016; 768 p. (In Russ.)
  9. Klimko N.N. Diagnosis and treatment of candidaemia and acute disse­minated candidiasis. Infektsionnaya i antimikrobnaya tera­piya. 2002; 4 (1): 30–37. (In Russ.)
  10. Ramage G., Walle K.V., Wickes B.L., Lopez-Ribot J.L. Standartized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001; 45 (9): 2475–2479. doi: 10.1128/aac.45.9.2475-2479.2001.
  11. Lisovskaya S.A., Glushko N.I., Khaldeeva E.V. et al. The effect of mycelial fungi in the adhesion of Candida albicans. Problemy meditsinskoy mikologii. 2010; 12 (1): 34–37. (In Russ.)
  12. Naglik J.R., Challacomber S.J. Candida albicans secreted aspartil proteinases in virulence and pathogehesis. Miccrob. Mol. Biol. Rew. 2003; 67: 400–428. doi: 10.1128/MMBR.67.3.400-428.2003. doi: 10.17816/KMJ2020-342

Supplementary files

Supplementary Files Action
1.
Рис. 1. Оптическая плотность биоплёнок, сформированных грибами Candida albicans при совместном культивировании с экстрактом гриба Fusarium solani в различных объёмах

View (17KB) Indexing metadata

Statistics

Views

Abstract - 30

PDF (Russian) - 17

Cited-By


PlumX


© 2020 Lisovskaya S.A., Valieva R.I., Sharifullina A.A., Fayzullina E.V., Khismatullina I.M., Khaldeeva E.V., Isaeva G.S.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.





This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies