Autotransplantation of immobilized stromal bone marrow cells during lumbar spondylosyndesis in an experiment

Full Text

Источником образования костной ткани при репаративном остеогенезе служат стволовые мезенхимальные клетки, обладающие способностью к остеобластической дифференцировке. Мы разработали собственный оригинальный способ создания локальной иммобилизованной популяции аутологичных стромальных клеток в зоне костного дефекта на твёрдофазовом пористом носителе. Этот способ основан на прямой пересадке идентифицированных собственных остеогенных клеток-предшественниц в виде фиксированной монокультуры с целью повышения качества и ускорения остеорепарации в неблагоприятных условиях тканевого дефекта. Целью проводимого исследования стала оценка способности аутологичных иммобилизованных стромальных клеток костного мозга обеспечивать эффективную репарацию с формированием полноценного костного блока в зоне межтелового дефекта двигательного сегмента позвоночника после тотального удаления межпозвонкового диска. Модель эксперимента В проведённом исследовании были использованы 24 взрослых беспородных разнополых собаки. Животные были сертифицированы и аккредитованы Управлением ветеринарии по Новосибирской области РФ с проведением всех процедур в строгом соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Средняя масса тела животных составляла 18,3 кг, средний диаметр тел поясничных позвонков по данным рентгенографии в двух стандартных проекциях - 18,6 мм. Всем животным в условиях экспериментальной операционной с соблюдением стандартных требований асептики и антисептики были выполнены: - пункция гребня крыла правой подвздошной кости с аспирацией 10 мл костного мозга; - тотальная дискэктомия на уровне тел VII и VIII поясничных позвонков с замещением межтелового дефекта пористым металлическим цилиндром из никелида титана соответствующих формы и размера. В качестве обезболивания при выполнении операций была использована многокомпонентная внутримышечная анестезия с применением в качестве базисного препарата кетамина в терапевтической дозе из расчёта на массу тела животного без интубации трахеи. Все животные случайным образом были разделены на четыре группы, по 6 в каждой. В первой группе межтеловой дефект заполняли только пористым металлическим цилиндром из никелида титана соответствующей формы и размера, во второй группе - фракцией мононуклеарных клеток костного мозга, в третьей - фракцией стромальных клеток, в четвёртой - фракцией выращенных в культуре стромальных клеток. Умерщвление животных для проведения морфологического исследования проводили по стандартной методике с применением кетаминовой эвтаназии в установленные сроки. Изоляция и культивирование стромальных стволовых клеток собак Каждый аспират костного мозга собирали в стеклянный флакон, содержащий 1 мл солевого раствора гепарина (1000 ЕД/мл). В лабораторном блоке флакон подвергали инкубации при 37 °C в течение 40 мин. После гравитационного разделения цельного костного мозга в отдельный флакон собирали верхнюю фракцию, состоящую из клеток лейковзвеси в аутоплазме. После центрифугирования (1500 об/мин, 8 мин) надосадок, содержащий аутоплазму, собирали в отдельный стерильный флакон, а осадок клеток лейковзвеси ресуспендировали в 20 мл фосфат-забуференного изотонического раствора натрия хлорида, содержащего 10 ЕД/мл гепарина. Затем клетки лейковзвеси наслаивали на раствор фиколла-верографина (1,078 г/л) и центрифугировали в течение 20 мин при 3000 об/мин. Собранные из интерфазы костномозговые мононуклеарные клетки троекратно отмывали и ресуспендировали в среде DMEM («Sigma-Aldrich»). Получив гомогенную клеточную взвесь, подсчитывали общее количество выделенных клеток (в среднем 8,5×106/мл), оценивали их жизнеспособность после окраски трипановым синим. Полученную фракцию прилипающих к пластику костномозговых клеток дополнительно культивировали в среде DMEM, дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 50 мкМ аскорбата-дифосфата, 0,1 мкМ дексаметазона, 0,3 мг/мл L-глутамина, 5 мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина при 37 °C в атмосфере 5% СО2. В таких условиях клетки культивировали в течение 21 сут с заменой культуральной среды через каждые 5 сут. Общее количество клеток к завершению культивирования составило в среднем 1,2 ×106/мл. Подготовка пористого металлического носителя из никелида титана За сутки до иммобилизации стромальных стволовых клеток цилиндрическую заготовку соответствующего размера обезжиривали, дезинфицировали, автоклавировали, затем инкубировали 2 ч при 37 °С в растворе коллагена (2 мг/мл) с 0,1 М уксусной кислоты, затем троекратно отмывали, высушивали в ультрафиолетовом ламинаре с вертикальным током воздуха. После этого заготовку повторно инкубировали 18 ч при 37 °С в среде DMEM, содержащей 0,4% раствор желатиноля и остеогенный индуктор β-глицерофосфат в концентрации 3 мг/мл. Клеточную взвесь медленно инъецировали в разных точках подготовленной каркасной конструкции из никелида титана. Фиксацию клеток проводили при 37 °С в СО2-инкубаторе в течение 30 мин. Затем помещали подготовленный клеточный носитель с иммобилизованными стромальными (мезенхимальными) клетками в стерильный флакон, содержащий среду DMEM с 10% аутоплазмы, укупоривали, маркировали и транспортировали из лабораторного блока в операционную. Результаты Оценка результатов исследования проведена с использованием рентгенографии в двух стандартных проекциях, визуальной оценки удалённых хирургическим путём препаратов позвоночного сегмента, а также гистологического исследования. В первой (контрольной) группе животных выявлены отчётливые признаки замедленного формирования переднего костного блока, образование гипертрофического межтелового псевдоартроза. Гистологическое исследование показало формирование грубой фиброзной капсулы в зоне контакта «имплантат-кость», избыток хрящевой ткани, малочисленность и низкую пролиферативную активность остеобластов и гипоплазию сосудов. Во второй группе животных на поздних сроках исследования определялся формирующийся артифициальный костный блок с паравертебральным гиперостозом. Рентгенологически выявлена микродислокация имплантата с его протрузией в тело смежного позвонка и частичная остеоинтеграция с пористой структурой фиксатора в зоне контакта «имплантат-кость». Гистологически образование костной ткани шло по типу вторичного остеогенеза с формированием избытка хрящевой ткани. В третьей и четвёртой группах к 6-му месяцу исследования формировался полноценный артифициальный костный блок. Достоверных различий в сроках и морфологических параметрах формирования костного блока между этими двумя группами не выявлено. Признаков дислокации имплантата не отмечено. Определялась полная остеоинтеграция с пористой структурой фиксатора в зоне контакта «имплантат-кость». Гистологически выявлены признаки первичного остеогенеза с полноценной остеорепарацией. Новообразованная костная ткань муфтообразно окружала имплантат и врастала в его пористую структуру, прорастала в периостальную зону тел смежных позвонков, прочно спаиваясь с их поверхностью. ВЫВОДЫ 1. Аутотрансплантация иммобилизованных стромальных клеток костного мозга может ускорять новообразование костной ткани при межтеловом спондилодезе после тотального удаления межпозвонкового диска. 2. Биоинертный пористый устойчивый к резорбции клеточный носитель из никелида титана обеспечивает продолжительную фиксацию и удержание клеточного материала в виде стабильной трёхмерной клеточной культуры.

About the authors

M V Kheifets

Scientific Research Institute of Clinical Immunology, Novosibirsk, Russia; Scientific Research Institute of Traumatology and Orthopaedics, Novosibirsk, Russia; 354th District Military Clinical Hospital, Russia

Email: gph4900@yahoo.com

References

Supplementary files