Development of a genetic test for evaluating 5-year survival of patients with acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome

Full Text

Генодиагностика острого миелобластного лейкоза (ОМЛ) - актуальная проблема современной онкогематологии. В классификации миелоидных опухолей, предложенной Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) в 2001 г. [5], генетический критерий (наличие определённых мутаций в специфических генах) был впервые использован в качестве диагностического, а при пересмотре 2008 г. указанная классификационная категория была значительно углублена и расширена, в том числе за счёт мутаций, имеющих прогностическую значимость (оказывающих влияние на выживаемость) [8]. Так, показано, что мутации в генах NPM1 и CEBPA ассоциированы с благоприятным прогнозом ОМЛ [1, 2, 7-9]. Наш выбор остановился на изучении мутаций в гене СЕВРА. CEBPA (C/EBPα, семейство CCAAT/enhancer binding protein), представляющих собой транскрипционный фактор, который имеет большое значение в миелоидной дифференцировке. Он участвует в образовании комплекса из трёх транскрипционных факторов [CEBPA, AML1(RUNX1) и CBFB], ведущего к активации промотoра гена макрофагального-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (MG-CSF), который играет критическую роль в миелоидной дифференцировке [3, 4, 6]. При этом любые мутации генов, кодирующих белки данного комплекса, даже при отсутствии цитогенетически определяемых аномалий, ведут к формированию лейкемического фенотипа, то есть нарушению дифференцировки и бесконтрольной пролиферации. Тем не менее, в соответствии с классификацией ВОЗ пересмотра 2008 г. [8], обнаружение мутаций в гене СЕВРА (биаллельных, двойных [7, 9]) позволяет стратифицировать больных в прогностически благоприятную группу даже в условиях проведения стандартной полихимиотерапии. Если рассматривать доменную структуру фактора СЕВРА, можно обнаружить функциональную неравнозначность N- и С-конца. На С-конце расположен домен с областью «лейциновой застёжки», благодаря которой происходят димеризация фактора и взаимодействие с дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК), тогда как 50-75% N-части фактора несут трансактивационные TAD1 и TAD2 [4, 6]. Ген CEBPA расположен в локусе 19q13.1, картирован. Мутации в гене подразделяются на N- и С-терминальные - в зависимости от участка гена, кодирующего соответствующие участки фактора. N-терминальные нонсенс-мутации ведут к синтезу изоформ с неполноценными трансактивационными участками TAD1 и TAD2. Миссенс-мутации на С-конце в области bZIP-домена приводят к нарушению процесса димеризации (дефектная «лейциновая застёжка») или нарушению связывания с энхансерами (дефектная основная ДНК-связывающая область), также становясь причиной образования функционально дефектных изоформ. Что примечательно, наиболее часто встречаются сочетания N- и С-концевых мутаций, причём исследования последних лет показывают, что наибольшую прогностическую значимость имеют именно эти комбинации [3, 4, 6, 7, 9]. Несмотря на большое количество фундаментальных и трансляционных исследований, на сегодняшний день не создан алгоритм диагностики мутаций гена СЕВРА, адаптированный для практического здравоохранения, а детекция всех мутаций (методом секвенирования) представляет собой дорогостоящий и требующий специального (также малодоступного) оборудования процесс. Следовательно, учитывая данные о наибольшей частоте и прогностической значимости комбинаций N- и С-концевых мутаций, в случае выделения «горячих точек» (сочетаний определённых мутаций) мы сможем создать тест, при использовании которого не понадобится прибегать к дорогостоящей и малодоступной методике секвенирования. Таким образом, разрабатываемый нами тест позволит выделить группы пациентов с благоприятным и неблагоприятным прогнозом, определяя тактику ведения больных: радикальность, агрессивность и стоимость лечения. Выделение тотальной рибонуклеиновой кислоты (РНК) проводили методом сорбции на силикагелевом носителе с помощью комплекта реагентов «РИБО-сорб» (ЦНИИ эпидемиологии, Москва) из 100 мкл цельной крови или 100 мкл костного мозга. Для проведения обратной транскрипции использовали набор «РЕВЕРТА-L-100» того же производителя. Участок гена CEBPA, включающий кодирующую часть первого экзона (последовательность нуклеотидов 81-1282), клонировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в виде двух перекрывающихся фрагментов с использованием двух пар праймеров - CEB-F1, CEB-R1 и CEB-F2, CEB-R2 (представлены в табл. 1). Позиции всех нуклеотидов указаны относительно кодирующей части гена CEBPA здорового человека (NM_004364 в GenBank). Для проведения ПЦР готовили смесь, включающую следующие компоненты: 4 ед. ДНК-полимеразы («ДиаТак», ЦНИИ эпидемиологии, Москва), 2 мM смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (дНТФ), 10 пM каждого из двух праймеров, реакционный буфер [67 мM Трис-HCl (pH 8,3), 2,5 мM MgCl2]. Для обеих пар праймеров ПЦР проводили по следующей схеме: 1 цикл - 950 °C (3 мин); 42 цикла - 950 °C (20 с), 630 °C (20 с), 720 °C (40 с); заключительный цикл - 720 °C (5 мин). Для анализа продуктов амплификации использовали электрофорез в 2% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием (0,5 мг/мл) и детекцией в ультрафиолетовом трансиллюминаторе. Секвенирование ДНК проводили на автоматическом генетическом анализаторе «ABI Prism 310» («AppliedBiosystems», США) с использованием реакционной смеси «ABI Prism Big Dye TerminatorCycleSequencingKit v.3.0» («AppliedBiosystems», США) по прямой и обратной последовательностям (праймеры CEB-F1, CEB-F2, CEB-SF2 для прямой и праймеры CEB-SR1, CEB-R2 для обратной последовательности, см. табл. 1) согласно рекомендациям производителя. Сопоставление сегментов, выравнивание и сравнение последовательностей нуклеотидов и аминокислот проводили с использованием компьютерной программы «MEGA», версия 3.1 (Kumar S., Tamura K., Nei M., 2004). Методика апробирована на клиническом материале (венозная кровь), полученном от здоровых людей, удалось определить первичную структуру описанной части гена CEBPA. Первичная структура полностью совпадает с «диким типом» (NM_004364 NCBI GenBank). Произведено секвенирование 16 образцов крови или пунктата костного мозга больных ОМЛ. Полученные данные проанализированы, за больными ведётся активное наблюдение. ВЫВОДЫ 1. Незначительное количество обследуемых пока не позволяет говорить о статистически достоверной корреляции между определёнными мутациями и прогностической значимостью, а также выделить комбинации наиболее частых мутаций. 2. В дальнейшем мы планируем исследование полиморфизма, эпигеномных модификаций, мутаций в других генах и расширение методик детекции (использование модификаций ПЦР и других методов). Таблица 1 Праймеры для амплификации и секвенирования части гена CEBPA Название Последовательность Область амплификации CEB-F1 5’ TCGCCATGCCGGGAGAACTCTAAC 3’ 81-657 п.н. CEB-R1 5’ CTGGTAAGGGAAGAGGCCGGCCAG 3’ CEB-F2 5’ CCGCTGGTGATCAAGCAGGA 3’ 580-1282 п.н. CEB-R2 5’ CACGGCTCGGGCAAGCCTCGAGAT 3’ CEB-SR1 5’ AGCTGCTTGGCTTCATCCTCCT 3’ Секвенирование CEB-SF2 5’ CAAGGCCAAGAAGTCGGTGGACA 3’ Секвенирование Примечание: п.н. - последовательность нуклеотидов.

About the authors

E V Glukhanyuk

Ural State Medical Academy, Ekaterinburg, Russia; Moscow State University named after M.V. Lomonosov, Moscow, Russia

Email: evgengluhanuk@gmail.com

References

Supplementary files