The search for genetic factors of predisposition to the development of liver cirrhosis in the course of viral hepatitis B in patients from the Republic of Bashkortostan

Full Text

Цирроз печени (ЦП) - универсальный финал многих хронических заболеваний печени. По мнению большинства специалистов, наиболее частые причины заболевания - злоупотребление алкоголем и вирусные гепатиты [4, 7, 10, 30, 40]. Среди причин смерти больных с патологией печени вирусные гепатиты продолжают занимать первое место в мире [18, 19, 28]. Развитие инфекционного процесса определяется не только свойствами возбудителя (вирулентность, контагиозность, лекарственная устойчивость и т.д.), но и индивидуальными генетически детерминированными особенностями макроорганизма-хозяина [5, 23]. Наследственная чувствительность к инфекционным агентам может быть связана с двумя факторами: относительно редкими генетическими дефектами, приводящими к иммунодефицитам, а также (более распространённый вариант) особенностями совокупности «нормальных» аллелей генов [23]. На сложность механизмов генетической подверженности вирусному поражению указывают многие исследователи [27, 36, 37, 39]. Показана роль ферментов семейства цитохромов Р-450 в развитии гепатита различной этиологии: вирусного, аутоиммунного, септического, а также вызванного ксенобиотиками, в том числе медикаментами и алкоголем, в процессах фиброзирования печени [1-3, 9, 24]. Активация ферментов семейства цитохромов Р-450 стимулирует развитие окислительного стресса, усиливает синтез в печени провоспалительных цитокинов. Особенно неблагоприятным считают сочетание повышенной активности ферментов I фазы детоксикации ксенобиотиков и снижения активности ферментов II фазы: нулевой генотип гена глутатион-S-трансферазы М1 и мутации (VAL/VAL) полиморфизма изофермента CYP1A1 гена цитохрома Р-450 [43]. Исследования полиморфизма гена GSTM1 при ЦП касаются в основном алкогольной природы заболевания. R.V. Burim и соавт. (2004) обнаружили увеличение частоты генотипа Val/Val у пациентов с алкогольным ЦП (15,4%) [16]. Не было обнаружено различий в распространённости в GSTM1 и GSTT1 нулевых генотипов между лицами, страдающими алкоголизмом, и группой контроля. При хроническом вирусном гепатите B (ВГВ) снижается общее содержание матричной рибонуклеиновой кислоты в гепатоците, что может способствовать повышенной восприимчивости печени к различного рода ксенобиотикам и канцерогенам [29]. В свете этого изучение мутаций генов детоксикации ксенобиотиков при хроническом ВГВ представляет большой интерес. С группой генов детоксикации ксенобиотиков тесно связаны гены, контролирующие обмен железа в организме человека [8]. Особый интерес вызывает синдром перегрузки железом, поскольку отмечено его неблагоприятное влияние на течение хронического вирусного гепатита С (ВГС) [12, 44, 31, 32]. Избыточное накопление железа в печени способствует воспалительно-деструктивному повреждению, ускоряя прогрессирование до стадии ЦП и рака печени [14, 15]. Мета-анализ девяти исследований показал, что Y аллель C282Y связан с риском гепатоцеллюлярной карциномы [38]. По данным Е.А. Кулагиной, определяющее значение в развитии синдрома перегрузки железом и возникновении нарушений углеводного обмена у больных хроническим ВГС отводится мутантным аллелям C282Y и H63D гена HFE [6]. По данным же других учёных, мутации С282Y и S65C не выявлялись ни в группе контроля, ни в группе больных ЦП, а распространённость гетерозиготности H63D составила 12% у здоровых людей и 14,8% среди пациентов с заболеваниями печени (26,3% при вирусном и 12,5% при криптогенном ЦП) [22]. Таким образом, существующие литературные данные носят противоречивый характер при несомненной актуальности проблемы. Цель работы - выявление клинико-генетических ассоциаций полиморфизмов генов детоксикации ксенобиотиков при ЦП, развившемся вследствие ВГВ. В исследование методом случайного отбора были включены 38 больных ЦП в возрасте от 25 до 54 лет, находившихся на стационарном лечении в гастроэнтерологическом отделении. Данные по степени компенсации по Child-Pugh [20] приведены в табл. 1. Диагноз подтверждали результатами общепринятых клинических, инструментальных, лабораторных и функциональных методов: биохимическое исследование сыворотки крови (альбумин, билирубин, креатинин, аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, щелочная фосфатаза, гаммаглутамилтранспептидаза, α-фетопротеин), маркёры вирусного гепатита в сыворотке крови [HBS антиген, HBC антитела, HBE антиген, количественная и качественная полимеразная цепная реакция (ПЦР) на дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) вируса гепатита В], пункционная биопсия печени под контролем ультразвукового исследования с последующим иммуногистохимическим исследованием на антигены вирусов ВГВ и ВГС, ультразвуковое допплеровское сканирование органов брюшной полости и сосудов печени и селезёнки с оценкой печёночного кровотока, компьютерная и магнитно-резонансная томография. Материалом для молекулярно-генетического исследования служили образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции [33]. Контрольную группу составили 147 здоровых человек, сопоставимых по полу, возрасту и национальности с основной группой. Амплификацию изучаемых локусов проводили с помощью метода ПЦР синтеза ДНК на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Москва). Перечень исследованных локусов, последовательности специфичных олигонуклеотидных праймеров, размеры амплифицируемых фрагментов, названия ферментов рестрикции и длины продуктов расщепления представлены в табл. 2. Для всех локусов амлификация была выполнена в 25 мкл общего объёма смеси, содержащей следующие обязательные компоненты: 25 мМ Tris-HCl, pH 8,4; 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), по 5 пМ каждого из праймеров, 10-20 нг тотальной ДНК и 0,5 единицы Taq ДНК-полимеразы «Termus aquaticus» (производства «Cилекс», Москва). Разделение фрагментов ДНК после амплификации и рестрикции выполняли при помощи электрофореза в 7% полиакриламидном геле. Детекцию результатов электрофореза проводили с использованием видеосистемы «Geldokulant» (Франция). Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0». При сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля, а также у лиц с различными диагнозами применяли критерий χ2. Для таблиц сопряжённости 2×2 использовали критерий χ2 с поправкой Йетса на непрерывность, если частота хотя бы в одной ячейке таблицы была меньше или равна 5, применяли точный критерий Фишера. В случае статистически значимых различий силу ассоциаций оценивали в значениях показателя соотношения шансов (Odds Ratio - OR), OR >1 рассматривали как положительную ассоциацию с аллелем или генотипом (фактор повышенного риска), а OR <1 - как отрицательную ассоциацию (фактор пониженного риска). Все статистические тесты выполняли для двустороннего уровня значимости, статистически значимыми считали различия при p <0,05 (р - уровень значимости критерия). Для выявления клинико-генетических ассоциаций полиморфизмов генов детоксикации ксенобиотиков были выбраны ген цитохромоксидазы Р-450 CYP1А1 (первая фаза детоксикации ксенобиотиков) и ген глутатион S-трансферазы М1 GSTM-1 (вторая фаза). Цитохром CYP1A1 - один из наиболее известных представителей семейства цитохромов Р-450, кодируется геном CYP1A1. Он экспрессируется главным образом в лёгких и печени. При замене аминокислоты изолейцина (Ile) на валин (Val) в кодоне 462 молекулы цитохрома Р-450 (Ile462Val) [25, 34] синтезируется фермент, активность которого почти в 2 раза выше, чем в исходном белке, что ведёт к увеличению доли токсических метаболитов I фазы детоксикации [21]. Для оценки II фазы исследован полиморфизм гена GSTM-1, который отвечает за реакцию конъюгации промежуточных метаболитов с восстановленным глутатионом. При делеции гена GSTM1 синтеза соответствующего белкового продукта не происходит [41]. Для оценки генов обмена железа проведён анализ мутаций C282Y, H63D, S65C в гене гемохроматоза (HFE) и Y250X в гене рецептора трансферрина (Tfr2) у больных ЦП различной этиологии. Мутации в гене HFE - причина развития первичного гемохроматоза 1-го типа. Tfr2 - трансмембранный белок, необходимый для поступления железа в клетку. Мутация Y250X в гене Tfr2, локализованном в области 7q22, приводит к развитию гемохроматоза 3-го типа [17]. У носителей гомозиготного генотипа 250Х/250X развивается накопление железа в раннем возрасте [35]. В работах R.V. Burim и соавт. (2004) показано увеличение частоты генотипа Val/Val (15,4%) при ЦП алкогольной природы по сравнению с ЦП другой этиологии [16]. В нашем исследовании при изучении полиморфизма гена CYP1A1 (табл. 3) у больных ЦП, вызванным вирусом ВГВ, установлено, что мутация Ile462Val встречалась в 5 раз чаще у больных ЦП вирусной (ВГВ) природы, чем в контроле (21,1 против 3,96%; c2=5,01; р=0,03; OR=6,47; ДИ=1,19-35,66). Кроме того, данная мутация статистически значимо чаще присутствовала у пациентов с ЦП смешанной природы: вирусной (ВГВ) + токсической (21,4%; c2=3,86; р=0,05; OR=6,61; ДИ=1,00-42,48). Мутация Ile/Val не выявлялась при ЦП на фоне ВГС, ВГВ + С, а также при вирусной (ВГС) + токсической и вирусной (ВГВ + С) + токсической этиологии. Таким образом, полученные данные позволяют считать генотип Ile462Val гена CYP1A1 цитохрома Р450 фактором риска развития ЦП на фоне ВГВ . Известно, что делеция гена глутатион-S-трансферазы вызывает полную потерю функций фермента, что ведёт к нарушению защиты клеток от канцерогенов, индуцирующих повреждения ДНК. Данную мутацию обнаруживают у 40-45% представителей европейских популяций. Увеличение частоты мутации до 67,7% среди больных хроническим ВГВ и до 47,4% у пациентов с хроническим ВГС выявлено в исследовании E. Abdel-Moneim и соавт. (2008) [11]. Изученный нами полиморфизм гена GSTM1 представлен двумя аллелями: нормальным (N) и мутантным (делеционным, del), приводящим к потере функций фермента [13] (табл. 4). Как следует из представленных результатов, при ЦП вирусной этиологии (ВГВ) доля гомозигот по делеции была статистически значимо больше, чем в контроле: c2=4,93; p=0,03; OR=3,33; ДИ=1,13-10,05. Анализ комбинаций генотипов выявил статистически значимое увеличение доли больных с генотипом Ile-Val/(+) среди больных ЦП на фоне ВГВ (21,05%; c2=8,67; р=0,004; OR=0,08; ДИ=0,009-0,54) по сравнению с группой контроля. Пациенты с генотипом Ile-Ile/(+) встречались статистически значимо реже: c2=7,04; р=0,01; OR=0,17; ДИ=0,04-0,69. Необходимо подчеркнуть, что двойная мутация - генотип Ile-Val/(0) - не выявлена ни у одного пациента при вирусной (ВГВ и ВГВ + С) и вирусной (ВГВ) + токсической этиологии (табл. 5). Избыток железа оказывает токсическое влияние практически на все клетки и ткани организма. В последнее время исследователи во всём мире получают новые данные, подтверждающие, что даже малые количества железа в печени могут быть фактором риска увеличения тяжести или прогрессирования «негемохроматозных» заболеваний печени. Так, небольшие количества железа могут аккумулироваться вследствие гетерозиготных мутаций в гене HFE [26]. Также возможно, что мутации в гене HFE влияют на развитие и прогрессирование заболеваний печени независимо от накопления железа. Это можно объяснить тем, что продукт гена HFE является белком главного комплекса гистосовместимости I типа, а его мутация может нарушать иммунный ответ [26]. По данным литературы, мутация C282Y гена гемохроматоза (HFE) у больных хроническим ВГС связана с повышением концентрации сывороточного железа и служит прогностическим фактором плохого ответа на противовирусную терапию [42]. Полученные нами результаты исследования C282Y, H63D и S65C мутаций в гене HFE у больных ЦП вирусной (ВГВ) этиологии представлены в табл. 6. Необходимо подчеркнуть, что ни у одного из пациентов исследуемой группы не была выявлена мутация C282Y гена HFE, тогда как в контроле данная мутация встречалась с частотой 3,3%. В целом статистически значимых различий по частоте мутаций в полиморфизмах C282Y, H63D у больных ВГВ и ВГВ + С не выявлено. Генотип S65C/N полиморфизма S65C гена HFE у больных с ЦП смешанного (ВГВ + токсическое воздействие) генеза был выявлен статистически значимо чаще, чем в контроле (соответственно 14,29 и 0,4%; c2=11,54; р=0,0015; OR=0,03; ДИ=1,79-222,6). Учитывая, что при алкогольном ЦП данная мутация также встречалась статистически значимо чаще (6,67%; c2=4,65; р=0,031; OR=0,06; ДИ=0,025-0,861), можно предположить, что данная мутация приводит к усилению токсического влияния алкоголя на печень, риск наиболее выражен при наличии дополнительного фактора - инфицирования вирусом ВГВ. ВЫВОДЫ 1. Полученные данные позволяют считать, что генотип Ile462Val гена CYP1A1 цитохрома Р450 и делеция гена глутатион-S-трансферазы М1 - факторы риска развития ЦП на фоне ВГВ. 2. Выявлено статистически значимое увеличение доли больных с генотипом Ile-Val/(+) среди пациентов с ЦП, развившимся вследствие ВГВ, по сравнению с группой контроля, в то же время генотип Ile-Ile/(+) встречался статистически значимо реже. 3. Установлена ассоциация генотипа S65C/N полиморфизма S65C гена HFE с ЦП смешанного (ВГВ + токсическое воздействие) генеза. Таблица 1 Характеристика больных по этиологии и Child-Pugh Этиология цирроза Всего Класс по Child-Pugh А В С Вирусная (гепатит В) 19 1 10 8 Вирусная (гепатит В + С) 5 - 1 4 Вирусная (гепатит В) + токсическая 14 - 4 10 Итого 38 1 15 22 Таблица 2 Полиморфизмы, последовательности праймеров и номенклатура аллелей анализируемых маркёров Ген Полиморфизм Последовательность праймеров Метод детекции Аллели (размер фрагментов, п.о.) Ссылка HFE C282Y 5`- ACCAGGGCTGGATAACCTTGG - 3`, GACTAGGGTGCCAGACGGTGA - 3` ПЦР/ПДРФ(RsaI) *C 261+25 *Y 229+32+25 Beutler E. et al., 1996 H63D 5`-CCCTCTCCACATACCCTTGCTG - 3`, AAGCTTTGGGCTACGTGGATGATCAG - 3` ПЦР/ПДРФ (MboI) *H 171+21 *D 192+20 Beutler E. et al., 1996 S65C 5’-GCT TTG GGC TAC GTG GAT GAC CAG-3’ 5’-CAA CAG TGA ACA TGT GAT CCC ACC-3’ ПЦР/ПДРФ (HinfI) *S 70+49+32 *C 119+32 Mura C. et al., 1999 Tfr2 Y250X 5’-TGC ACT GGG TCG ATG AG-3’ 5’-CTC AAG CCC TCC CTC T -3’ ПЦР/ПДРФ FspB1 *Y 238+117 *X 134+104 Marco De Gobbi et al., 2001 GSTM1 Del 5’-CTG CCC TAC TTG ATT GAT GGG-3’ 5’-CTG GAT TGT AGC AGA TCA TGC-3’ ПЦР Норма 271 Del - отсутствует Komstock, 1990 CYP1A1 A2455G Ile462Val 5’-GAA GTG TAT CGG TGA GAC CA-3’ 5’-GTA GAC AGA GTC TAG GCC TCA-3’ ПЦР/ПДРФ (HincII) *Ile 139+48 *Val139+48+19 Oyama T. et al., 1995 Примечание: ПЦР - полимеразная цепная реакция; ПДРФ - анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов; п.о. - пара оснований. Таблица 3 Распределение частот вариантов полиморфного локуса Ile 462Val гена CYP1A1 у больных циррозом печени по сравнению с группой контроля Причина заболевания Генотип c2 p Ile/Ile Ile/Val Абс. % Абс. % Вирус гепатита В, n=19 15 78,9 4 21,1 5,01 0,03 Вирус гепатита В + С, n=5 5 100 - - 0,001 1 Вирусный гепатита В + токсическое воздействие, n=14 11 78,6 3 21,4 3,86 0,05 Контроль, n=101 97 96,04 4 3,96 Таблица 4 Распределение частот вариантов полиморфного локуса гена GSTM1 больных циррозом печени Причина заболевания Генотип c2 p 0/0 (del) «+» (N) Абс. % Абс. % Вирус гепатита В, n=19 12 63,2 7 36,8 4,93 0,03 Вирус гепатита В + С, n=5 2 40 3 60 0,001 1,5 Вирусный гепатита В + токсическое воздействие, n=14 7 50 7 50 0,82 0,57 Контроль, n=147 50 34,01 97 65,99 Таблица 5 Комбинации генов детоксикации ксенобиотиков CYP1A1 и GSTM1 у больных циррозом печени Форма заболевания Генотипы: CYP1A1/GSTM1 Ile-Ile/(+) Ile-Ile/(0) Ile-Val/(+) Ile-Val/(0) Абс. % c2 p Абс. % c2 p Абс. % c2 p Абс. % c2 p Вирусный гепатит В, n=19 3 15,79 7,04 0,01 12 63,16 1,63 0,2 4 21,05 8,67 0,004 - - - - Вирусный гепатит В + С, n=5 3 60 0,001 1 2 40 0,001 1 - - - - - - - - Вирусный гепатит В + токсическое воздействие, n=14 6 42,86 0,13 0,73 5 35,71 0,1 0,76 1 7,14 0,06 0,81 2 14,29 2,53 0,11 Контроль, n=102 53 51,96 45 44,12 2 1,96 2 1,96 Таблица 6 Комбинации генов гемохроматоза у больных циррозом печени Этиология цирроза HFE C282Y H63D S65C N C282Y/N c2 р N H63D/N c2 р N S65C/N c2 р Абс. % Абс. % Абс. % Абс. % Абс. % Абс. % Вирусный В, n=19 19 100 0 0 0,015 0,91 16 84,21 3 15,79 0,03 0,87 19 100 0 0 0,001 1,001 Вирусный В + С, n=5 5 100 0 0 0,001 1,001 5 100 0 0 0,01 0,92 5 100 0 0 0,001 1,001 Вирусный В + токсический, n=14 14 100 0 0 0,001 1,001 12 85,71 2 14,29 0,001 1,001 12 85,71 2 14,29 11,5 0,002 Контроль 232 96,7 8 3,3 212 88,3 28 11,7 239 99,6 1 0,4

About the authors

G T Gusmanova

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

Email: ggtmail@mail.ru

D Kh Kalimullina

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

A B Bakirov

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

R I Khusainova

Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Scientific Center, Russian Academy of Sciences, Ufa, Russia

References

Supplementary files