Features and role of lipid peroxidation in patients with chronic hepatitis C (genotype 1b) before and after antiviral therapy

Full Text

Известно, что у больных хроническими вирусными гепатитами развивается дисфункция системы мононуклеарных фагоцитов, основными проявлениями которой служат резкое повышение уровня провоспалительных цитокинов, истощение ферментного и субстратного звеньев антиоксидантной системы сыворотки крови, дисбаланс системы интерферона и другие признаки вторичной иммунной недостаточности [1, 3]. Чрезмерная активация цитокиновой сети с гиперпродукцией преимущественно провоспалительных цитокинов, генерацией активных форм кислорода и последующим истощением антиоксидантного потенциала сыворотки крови являются важными звеньями патогенеза хронического гепатита С (ХГС) и способствуют снижению эффективности этиотропной терапии [4]. Повреждение мембранного аппарата гепатоцитов радикалами кислорода приводит и к нарушениям рецепции биологически активных веществ, в том числе противовирусных средств [2]. Показано, что при проведении интерферонотерапии в результате индуцированной цитокинами повышенной активности фермента ксантиноксидазы усиливается процесс образования активных форм кислорода в гепатоцитах [1]. Таким образом, в патогенезе повреждения печени при инфекции, обусловленной вирусом гепатита С (HCV), важную роль играет нарушение равновесия системы перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты с накоплением токсических форм свободных радикалов и реактивных метаболитов при одновременном наличии иммунологических нарушений. Дисбаланс в оксидантной и антиоксидантной системах может способствовать прогрессированию заболевания, развитию цирроза печени, а также малигнизации [3, 4]. Цель работы - установить содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в эритроцитах больных ХГС с генотипом 1b до начала противовирусной терапии (ПВТ) и после её завершения. Обследованы 195 пациентов с ХГС с различным уровнем аланинаминотрансферазы (АЛТ) в сыворотке крови. Мужчин было 92, женщин - 103, средний возраст составил 44,8±3,5 года. Критерием включения в исследование было наличие у пациентов подтверждённого (анамнестическими, клинико-лабораторными данными) ХГС в фазе репликации (РНК HCV+), генотип вируса - 1b. Критериями исключения были наличие антител к вирусу иммунодефицита человека и клинически значимых заболеваний печени (например, алкогольная болезнь печени, приём гепатотоксичных лекарственных препаратов, аутоиммунный хронический гепатит, гемохроматоз, цирроз печени). Все больные были комплексно обследованы с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов. Диагноз ХГС подтверждали выявлением в сыворотке крови специфических антител к антигенам HCV (суммарные антитела, иммуноглобулины класса G) и РНК HCV методом полимеразной цепной реакции с идентификацией генотипа и количества вируса. Определяли содержание диеновых конъюгатов, триенкетонов, оснований Шиффа после экстракции их из мембран эритроцитов смесью хлороформ/изопропанол (2:1) по методу И.Д. Стальной в модификации И.А. Волчегорского. Спектрофотометрию липидного экстракта проводили при четырёх длинах волн: 220, 232, 278, 440 нм. Поглощение при 220 нм соответствовало оптической плотности изолированных двойных связей и характеризовало степень ненасыщенности липидов мембран эритроцитов (индекс окисленности). Значения экстинций при 232 и 278 нм являются функцией содержания первичных (диеновые конъюгаты) и вторичных (триенкетоны) продуктов ПОЛ в липидном экстракте. Значение экстинкции при 440 нм характеризовало содержание конечных продуктов ПОЛ - оснований Шиффа. Результаты представляли в виде соотношений Е232/Е220, Е278/Е220, Е440/Е220, которые отражают относительный уровень первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ соответственно. В качестве контрольной группы обследованы 50 доноров. В зависимости от активности АЛТ все пациенты до начала ПВТ были распределены на четыре группы: первая группа (n=52) - больные с нормальным уровнем АЛТ, вторая группа (n=74) - с уровнем АЛТ до 3 норм, третья группа (n=42) - от 3 до 5 норм, четвёртая группа (n=27) - более 5 норм. Пациенты получали пэгинтерферон альфа-2b подкожно в дозе 100 мкг 1 раз в неделю и рибавирин по 1000 мг в сутки ежедневно в течение 48 нед. В период лечения проводили ежемесячное клиническое и биохимическое мониторирование. РНК HCV определяли через 1 мес от начала терапии, затем каждые 3 мес лечения. Всем пациентам проводили ультразвуковое трансабдоминальное сканирование органов брюшной полости до начала терапии, далее каждые 6 мес. Проведённое исследование было одобрено этическим комитетом, все пациенты давали информированное согласие на участие в исследовании. Статистическую обработку и графическую визуализацию данных производили с использованием приложений Microsoft Excel пакета Office 2007 и Statistica (StatSoft) версии 6.0, функционировавших в операционной среде Microsoft Windows 7 Professional. Содержание продуктов ПОЛ (отн.ед.) в эритроцитах больных ХГС в зависимости от уровня АЛТ до начала ПВТ представлено в табл. 1. После того как пациенты прошли 48-недельный курс ПВТ по указанной выше схеме, мы повторно определили содержание продуктов ПОЛ в эритроцитах больных ХГС на момент непосредственного вирусологического ответа, данные представлены в табл. 2. Нужно отметить, что ПВТ была прекращена у 39 пациентов (у 24 человек был зарегистрирован вирусологический прорыв, у 15 - отсутствие раннего вирусологического ответа). При детальном рассмотрении изменений содержания ПОЛ до и после завершения ПВТ, а также у пациентов, не ответивших на ПВТ, выявлены следующие закономерности (см. табл. 2). Уровень содержания продуктов ПОЛ как до начала, так и после проведения ПВТ был повышен по сравнению с группой здоровых (p <0,01). У пациентов, не получивших ПВТ в полном объёме из-за отсутствия раннего вирусологического ответа или в связи с вирусологическим прорывом, все показатели ПОЛ достоверно были выше по сравнению как со здоровым (p <0,001), так и с пациентами из других групп (p <0,01). Выявлено, что у всех обследуемых больных ХГС как до начала, так и после ПВТ количество диеновых конъюгатов было достоверно выше нормы. Содержание диеновых конъюгатов в мембранах эритроцитов больных ХГС до начала ПВТ находилось в прямой зависимости от активности АЛТ в сыворотке крови. У пациентов с повышением активности АЛТ более чем в 2-3 раза уровень диеновых конъюгатов был значительно повышен и составлял от 0,89 до 1,02 отн.ед. По нашим данным, в группе здоровых содержание триенкетонов было значительно ниже (p <0,01), чем у больных ХГС во всех группах с повышенной активностью АЛТ. При этом уровень вторичных продуктов ПОЛ у больных ХГС, не ответивших на ПВТ, был достоверно выше аналогичных показателей у больных до начала ПВТ и в группе с непосредственным вирусологическим ответом (0,94±0,09 против 0,74±0,11 и 0,48±0,13 отн.ед. соответственно, p <0,01). Зарегистрировано увеличение содержания оснований Шиффа у больных ХГС, при этом максимальный показатель конечных продуктов ПОЛ (0,41±0,04 отн.ед. при норме 0,15±0,05 отн.ед., p <0,01) соответствовал выраженной активности АЛТ (более 5 норм). До начала ПВТ у пациентов с ХГС выявлено повышение оснований Шиффа почти в 2 раза и установлено снижение их уровня после завершения ПВТ. Однако максимальное значение оснований Шиффа (0,51±0,05 отн.ед.) зафиксировано в группе больных, не ответивших на ПВТ. Содержание двойных связей в исследуемом образце характеризовалось индексом окисленности. Данный показатель также значительно изменялся в зависимости от выраженности синдрома цитолиза у обследованных больных, составив 0,91±0,13 отн.ед. при нормальных значениях АЛТ и 1,91±0,03 отн.ед. при АЛТ более 5 норм в сыворотке крови. Это указывало на тот факт, что при хроническом воспалительном процессе вследствие снижения эффективности окислительного фосфорилирования включаются компенсаторные механизмы и активизируется электронный транспорт через альтернативные пути. Индекс окисленности у пациентов, не ответивших на ПВТ, был зарегистрирован как максимально выраженный и составил 1,61±0,12 отн.ед., что достоверно отличалось от здоровых (0,51±0,06 отн.ед., группы пациентов до начала терапии - 1,48±0,14 отн.ед., группы больных после её завершения - 0,88±0,16 отн.ед., p <0,01). Учитывая патогенетическую значимость дисбаланса оксидантной и антиоксидантной систем в обеспечении общего гомеостаза организма, при прогрессировании хронического заболевания важно своевременно диагностировать проявления окислительного стресса и эффективно корректировать их с помощью проводимой комплексной терапии. ВЫВОДЫ 1. У пациентов с хроническим вирусным гепатитом С отмечено повышение содержания продуктов перекисного окисления липидов в эритроцитах. 2. Высоким значениям активности аланинаминотрансферазы соответствовали более выраженные изменения содержания продуктов перекисного окисления липидов в эритроцитах. 3. После завершения противовирусной терапии содержание продуктов перекисного окисления липидов в эритроцитах у больных хроническим гепатитом С снизилось, но не нормализовалось. 4. Повышенное содержание продуктов перекисного окисления липидов в эритроцитах у пациентов с хроническим гепатитом С, не ответивших на противовирусную терапию, может служить одним из предикторов неэффективности проводимого лечения. Таблица 1 Содержание продуктов перекисного окисления липидов (отн.ед.) в эритроцитах пациентов с хроническим гепатитом С в зависимости от уровня аланинаминотрансферазы до начала противовирусной терапии (M±m) Показатели Здоровые, n=50 Пациенты с хроническим гепатитом С Первая группа, n=52 Вторая группа, n=74 Третья группа, n=42 Четвёртая группа, n=27 Диеновые конъюгаты 0,46±0,07 0,71±0,04* p2<0,05 p3 < 0,05 p4 < 0,05 0,89±0,05* p1 <0,05 p3 <0,05 p4 <0,05 0,97±0,06* p1 <0,05 p2 >0,05 p4 >0,05 1,02±0,03* p1 <0,05 p2 <0,05 p3 >0,05 Триенкетоны 0,35±0,90 0,45±0,08* p2 >0,05 p3 <0,05 p4 <0,05 0,69±0,11* p1 <0,05 p3 >0,05 p4 <0,05 0,79±0,19* p1 <0,05 p2 >0,05 p4 >0,05 0,94±0,02* p1 <0,05 p2 <0,05 p3 >0,05 Основание Шиффа 0,15±0,05 0,17±0,04* p2 >0,05 p3 <0,05 p4 <0,05 0,31±0,05* p1 >0,05 p3 >0,05 p4 <0,05 0,34±0,03* p1 <0,05 p2 >0,05 p4 >0,05 0,41±0,04* p1 <0,05 p2 <0,05 p3 >0,05 Индекс окисленности 0,51±0,06 0,91±0,13* p2 >0,05 p3 <0,05 p4 <0,05 1,02±0,11* p1 >0,05 p3 <0,05 p4 <0,05 1,75±0,27* p1 <0,05 p2 <0,05 p4 >0,05 1,91±0,03* p1 <0,05 p2 <0,05 p3 >0,05 Примечание: *статистическая значимость различий по сравнению с контролем (здоровыми): p1 - для больных хроническим гепатитом С первой группы, p2 - для второй группы, p3 - для третьей группы, p4 - для четвёртой группы; первая группа - лица с нормальным уровнем аланинаминотрансферазы, вторая - до 3 норм, третья группа - от 3 до 5 норм, четвёртая группа - более 5 норм. Таблица 2 Содержание продуктов перекисного окисления липидов (отн.ед.) в эритроцитах пациентов с хроническим гепатитом С (ХГС) до начала и после завершения противовирусной терапии (ПВТ), в том числе у лиц, не ответивших на неё (M±m) Показатели Здоровые, n=50 (0) До начала ПВТ, n=195 (1) После завершения ПВТ (ответившие на терапию), n=156 (2) Пациенты не ответившие на ПВТ, n=39 (3) Диеновые конъюгаты 0,46±0,07 0,91±0,05* p1-2<0,01 0,60±0,02* p2-3<0,01 1,12±0,07* p1-3<0,01 Триенкетоны 0,35±0,90 0,74±0,11* p1-2<0,01 0,48±0,13* p2-3<0,01 0,94±0,09* p1-3<0,01 Основание Шиффа 0,15±0,05 0,37±0,04* p1-2<0,01 0,26±0,02* p2-3<0,01 0,51±0,05* p1-3<0,01 Индекс окисленности 0,51±0,06 1,48±0,14* p1-2<0,01 0,88±0,16* p2-3<0,01 1,61±0,12* p1-3<0,01 Примечание: *статистическая значимость различий по сравнению с контролем (здоровыми): p1-2 - для больных ХГС до начала и после завершения ПВТ (у пациентов, ответивших на терапию); p2-3 - для показателей после завершения ПВТ у больных ХГС, ответивших и не ответивших на ПВТ; p1-3 - для показателей у больных ХГС до начала ПВТ и больных, не ответивших на ПВТ.

About the authors

D Yu Konstantinov

Samara State Medical University, Samara, Russia

Email: foges@rambler.ru

A A Suzdal’tsev

Samara State Medical University, Samara, Russia

References

Supplementary files