Functional properties of mesenchymal multipotent stromal stem cells obtained from bone marrow of patients with liver cirrhosis

Full Text

Аутологичные мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (АММСК) - соматические клетки, способные к самоподдержанию и дифференцировке в различных направлениях [2, 3, 7, 8]. Проводятся научные исследования, направленные на изучение эффективности использования АММСК для стимуляции регенераторного и репаративного потенциала в повреждённых тканях [4]. Экспериментальные исследования на моделях подтвердили положительный клинический эффект при лечении различных заболеваний, в том числе цирроза печени (ЦП) [5, 6]. Ряд исследователей высказывают мнение о том, что положительный клинический эффект при ЦП преимущественно связан не с приживлением или трансдифференцировкой трансплантированных АММСК, а с паракринным и опосредованным воздействием на повреждённые ткани [2]. Данная гипотеза была подтверждена исследованиями биологических свойств АММСК на их способность вызывать неоваскуляризацию в поражённых тканях, оказывать антиапоптотический эффект и стимулировать на этом фоне репаративные процессы [1]. Внедрение в клиническую практику аутологичных клеточных линий оказалось безопасным. Полученные из костного мозга больных ЦП АММСК отвечают критериям для их культивации и использования в последующем для клеточной трансплантации [5]. Цель работы - изучение функциональных свойств АММСК у больных ЦП различной этиологии. Изучены функциональные и фенотипические свойства АММСК, полученных из костного мозга у 35 пациентов (26 мужчин и 9 женщин) с ЦП в возрасте 19-53 года. Среди исследуемых пациентов вирусная этиология была диагностирована у 18 (51,4%), алкогольная - у 13 (37,1%), аутоиммунная - у 4 (11,4%) больных ЦП. Все наблюдаемые больные получали стационарное лечение в Донецком институте неотложной и восстановительной хирургии им. В.К. Гусака (Украина). Степень тяжести исследуемых больных оценивали по шкале Чайлд-Пью (Child-Pugh, класс А - n=18, класс В - n=14, класс С - n=3). Предварительно пациенты были ознакомлены с планируемыми манипуляциями, методикой трансплантации, возможными побочными эффектами, осложнениями и применяемыми технологиями. В последующем согласие пациента подтверждалось в письменной форме. Проводили полное клиническое, инструментальное и лабораторное обследование каждого пациента. Получение АММСК осуществляли путём извлечения костного мозга пункцией крыла подвздошной кости. Полученную суспензию разбавляли раствором Хенкса («Биолот», Россия) в соотношении 1:2,5. Центрифужные пробирки ёмкостью 5 мл заполняли градиентом Histopaque 1077 («Sigma», США), на который наслаивали разбавленный костный мозг (в соотношении 1:1) и центрифугировали при комнатной температуре в режиме 1800-2000 оборотов в минуту в течение 30-40 мин. Образовавшееся интерфазное кольцо с ядросодержащими клетками костного мозга промывали раствором Хенкса и осаждали центрифугированием при 800-1000 оборотах в минуту в течение 8-10 мин. Процедуру отмывки повторяли 3 раза. Образовавшийся осадок смешивали с ростовой средой, содержащей смесь модифицированной по способу Дульбекко среды Игла и субстрата Хэма F-12 (DMEM/F12, «Sigma», США), 20% эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС, «Биолот», Россия), митогены. Затем высевали на пластиковые флаконы площадью 75 см2 («Nuclon», США) с плотностью 1-2×105 клеток на 1 см2 и помещали в СО2-инкубатор (37 °C, 5% СО2). Через 3 сут среду DMEM/F12 заменяли на среду Дульбекко, модифицированную по способу Исков (IMDM) с 10% ЭТС, 2 ммоль L-глутамина и 10-4 моль 2-меркаптоэтанола («Sigma», США), удаляя не прикрепившиеся гемопоэтические клетки, и культивировали полученные ММСК в течение 42 дней. Обязательным было исследование биологического материала на стерильность по отношению к возможной бактериальной либо вирусной контаминации. Деление АММСК оценивали получением конфлюэнтного роста в первичной культуре (первый пассаж), а также по числу «дочерних» клеток в расчёте на 1 фибробластную колониеобразующую единицу (КОЕ-Ф). На начальном этапе исследования число клоногенных прекурсоров АММСК изучали по числу КОЕ-Ф. Для этого 1×106 АММСК костного мозга в течение 14 сут культивировали в чашках Петри («Nunclon», Дания) в минимальной среде Игла, альфа-модификация с 20% эмбриональной сывороткой теленка. После указанной процедуры полученные клеточные линии окрашивали по Романовскому-Гимзе и осуществляли подсчёт числа колоний, которые содержали не меньше 50 фибробластоподобных клеток. Для изучения иммуносупрессивных свойств АММСК использовали метод проточной цитофлюориметрии с использованием FITC- или PE-меченых моноклональных анти-CD3, -CD14, -CD16, -CD20, -CD34, -CD73, -CD90, -CD105, -HLA-DR антител на лазерном клеточном анализаторе (FACS Calibur, США). Определение относительного содержания CD4+CD45RO+, CD4+CD45RA+, CD8+CD45RO+ и CD8+CD45RA+ Т-лимфоцитов, а также CD4+CD25high и CD4+FOXP3+ регуляторных Т-клеток использовали FITC-меченые анти-CD4, -CD8 и -CD25 («Сорбент», Россия) и РЕ-меченные анти-CD45RO, -СD45RA и FOXP3 моноклональные антитела («Becton Dickinson», США). Определение функциональной активности АММСК изучали по концентрации цитокинов в супернатантах конфлюэнтных и стандартизированных культур, исследование осуществляли на 2-лучевом лазерном автоматизированном анализаторе «BioPlex Protein Assay System» (США) с использованием тест-систем «Human Cytokine 17-Plex Panel». Содержание эритропоэтина оценивали с помощью иммуноферментного анализа («Pro-Con EPO-HS», «Протеиновый контур», Россия), определяли количество инсулиноподобного фактора роста-1 («Diagnostic System Laboratories», США), основного фактора роста фибробластов («Biosource», Бельгия), фактора роста эндотелия сосудов («Human VEGF Immunoassay Kit», «Invitrogen», США) и HLA-G («Exbio», Чехия). При статистической обработке вычисляли средние значения полученных выборок (M), стандартные ошибки (m), минимальные (min) и максимальные (max) значения рядов. Для проверки и уточнения полученных результатов использован непараметрический критерий - W-критерий Уайта. Исследования показали, что стволовые клетки, изъятые у больных ЦП, отличались между собой адгезивностью, скоростью роста, временем культивирования, а также другими клинико-морфологическими особенностями. В табл. 1 наглядно показаны результаты изучаемых показателей функциональных и фенотипических свойств АММСК. Показатели нормы получены исследованием АММСК у 10 человек, получавших лечение в международном центре клеточного культивирования «Biostem» по поводу омоложения организма в профилактических целях. У указанных пациентов соматических заболеваний в анамнезе не было. Анализ исходного количества АММСК показал (см. табл. 1), что у пациентов с алкогольной этиологией развития ЦП количество КОЕ-Ф составляло в среднем 32 колонии на 106 мононуклеарных клеток. Содержание КОЕ-Ф при аутоиммунной форме развития ЦП было сопоставимым с аналогичным вышеуказанной категории больных. У больных с вирусной этиологией развития ЦП оно было в 1,5 раза выше. АММСК, полученные у всех наблюдаемых пациентов, были способны к делению. Наибольший выход и скорость удвоения клеточных популяций были обнаружены у пациентов с вирусной этиологией развития ЦП (см. табл. 1). Сравнительные морфометрические исследования первичных культур АММСК, полученных у больных с аутоиммунным и алкогольным гепатитом, показали наличие относительно мелких клеток (менее 20 мкм), составляющих около 30% среди общего числа клеток. В то же время у больных с вирусной этиологией заболевания в полученных из костного мозга культурах число мелких клеток было в 1,5 раза больше, что в процентном соотношении составляло около 49% общего числа популяции клеток. Фенотипический анализ АММСК показал, что подавляющее большинство культивируемых АММСК вне зависимости от этиологии развития ЦП экспрессировало специфичные для последних «стромальные» маркёры типа CD73, CD90 и CD105. При определении цитокинового профиля было обнаружено, что изъятые из костного мозга наблюдаемых больных ЦП АММСК синтезировали интерферон γ, интерлейкин-6 (IL-6), хемокины - IL-8 и моноцитарный хемоаттрактантный протеин-1, а также основной фактор роста фибробластов, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, фактор роста эндотелия сосудов и инсулиноподобный фактор роста-1 (рис. 1). Однако отмечены некоторые их особенности. Так, при вирусной и аутоиммунной этиологии ЦП АММСК по уровню и профилю секретируемых Th1/про- и Th2/противовоспалительных цитокинов практически были одинаковы. Исключение составил IL-13. Он не синтезировался при вирусном гепатите, но определялся в супернатантах при аутоиммунной форме заболевания. При аутоиммунном ЦП полученные АММСК отличались сниженной интенсивностью секреции фактора роста эндотелия сосудов, инсулиноподобного фактора роста-1 и макрофагального воспалительного протеина-1β и повышенным уровнем образования IL-8. При алкогольном поражении печени (в отличие от вирусной и аутоиммунной форм поражения) АММСК сравнительно интенсивно секретировали интерферон γ, IL-2, IL-1β, фактор некроза опухоли α, IL-4, IL-6, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, фактор, стимулирующий колонии макрофагов-гранулоцитов, и хемокины. Таким образом, судя по уровню синтеза цитокинов, АММСК, выделенные из костного мозга больных алкогольным ЦП, характеризовались наиболее выраженным провоспалительным и иммунорегуляторным потенциалом. Сравнительный анализ изучения иммуносупрессивных свойств полученных АММСК показал, что наиболее выраженной супрессией в анти-CD3-стимулированных культурах отличались клетки, изъятые у больных ЦП вирусной этиологии. Последние в соотношении 1:1-1:4 подавляли пролиферацию Т-клеток в среднем на 51 и 42% соответственно. Антипролиферативная же активность полученных АММСК при аутоиммунном и алкогольном поражении печени в соотношении 1:1 была сопоставимой (39 и 68% супрессии). У последних при уменьшении числа АММСК в культуре отмечалось отчётливое ослабление иммуносупрессивного потенциала. Учитывая вышеуказанное, можно обнаружить, что АММСК различного тканевого происхождения в целом отвечают минимальным критериям, для использования последних для трансплантации при лечении ЦП. Однако необходимо иметь ввиду их определённые тканеспецифические особенности и по возможности проводить коррекцию. Как показали исследования, АММСК при алкогольном поражении печени отличаются максимальным количеством клоногенных прекурсоров, при аутоиммунном гепатите - наибольшей пролиферативной активностью, при вирусном гепатите отличаются выраженным остеогенным потенциалом. При ЦП у всех наблюдаемых больных число клоногенных прекурсоров АММСК (КОЕ-Ф), изъятых из пунктата костного мозга больных, было снижено. Наиболее выраженное и статистически значимое снижение количества КОЕ-Ф отмечено у пациентов с алкогольным и аутоиммунным ЦП. Характерно, что, несмотря на сниженное число КОЕ-Ф, культуры АММСК вне зависимости от этиологии ЦП отличались большей продолжительностью культивирования и снижением количества «дочерних» клеток, которые генерируются одной КОЕ-Ф. Данный факт не зависел от количества КОЕ-Ф, что указывает на нарушение пролиферативного потенциала АММСК при ЦП. Результаты исследования секреторной активности показали, что МСК больных обладали функциональным потенциалом для поддержания стимуляции неоваскулогенеза/ангиогенеза (фактор роста эндотелия сосудов, основной фактор роста фибробластов) и нейрорегенерации (инсулиноподобный фактор роста-1, основной фактор роста фибробластов, IL-6). Иммуносупрессивная активность АММСК, полученных из костного мозга больных ЦП, проявлялась только при высоких количествах (при соотношении АММСК и отвечающих Т-клеток 1:1-1:2). При низких концентрациях АММСК (соотношения 1:10 и 1:100) либо не подавляли (при вирусной этиологии ЦП), либо усиливали (у больных аутоиммунным и алкогольным ЦП) пролиферативную активность Т-клеток. Таким образом, наши исследования показали снижение супрессивной и возрастание иммуностимулирующей активности АММСК при ЦП вне зависимости от этиологии заболевания. Учитывая литературные данные о сопряжённости пролиферативного и дифференцировочного потенциалов АММСК, мы с помощью коррекции пролиферативной активности поставили цель усилить их дифференцировочный и супрессивный потенциал при ЦП различной этиологии. В качестве корригирующего ростового фактора мы использовали основной фактор роста фибробластов. Наши исследования показали, что добавление основного фактора роста фибробластов в культуры АММСК приводило к снижению длительности культивирования до получения монослоя, а также возрастанию числа клеток в соответствующей фазе (S/G2M) клеточного цикла (с 2,86±0,94 до 8,72±2,31) в общем числе наблюдаемых нами больных. Следует отметить, что возрастание пролиферативной активности АММСК под воздействием основного фактора роста фибробластов не при каждой форме ЦП (в зависимости от этиологии заболевания) приводило к усилению супрессивной активности. Усиление супрессивной активности в присутствии основного фактора роста фибробластов отмечено в культурах АММСК, полученных из костного мозга больных с алкогольной и аутоиммунной формами заболевания. Основной фактор роста фибробластов не усиливал супрессивную активность АММСК больных с аутоиммунной этиологией развития ЦП. Таким образом, АММСК больных ЦП в зависимости от этиологии характеризуются изменениями количества клоногенных предшественников в костном мозге, а также нарушениями пролиферативной и иммунорегуляторной их активности в культуре in vitro. Основной фактор роста фибробластов повышает пролиферативный, дифференцировочный и иммуносупрессивный потенциал АММСК, что позволяет использовать его для стимуляции роста и коррекции функциональной активности, исключением при котором является аутоиммунный гепатит. ВЫВОД Функциональные и фенотипические свойства аутологичных мезенхимальных стволовых клеток при различных формах цирроза печени различаются, что требует проведения адекватной их культивации и коррекции перед трансплантацией. Таблица 1 Сравнительная характеристика количества клоногенных предшественников и пролиферативный потенциал аутологичных мезенхимальных мультипотентных стволовых клеток Этиология цирроза печени Изучаемые показатели Вирусная (n=18) Алкогольная (n=13) Аутоиммунная (n=4) Показатели нормы (n=10) Количество КОЕ-Ф на 106 МНК 25,8±4,1 (14-38) 16,4±3,8* (13-32) 19,3±5,6 (11-28) 33,3±4,8 (25-52) Длительность первичного культивирования, дни 14,5±3,5 (13-32) 15,8±4,4* (14-22) 17,1±5,9 (13-20) 13,8±0,9 (11-18) Выход АММСК в расчёте на 1 КОЕ-Ф 860±155 (580-1350) 818±161** (610-1230) 890±120 * (620-1400) 1600±280 (900-2600) Количество удвоений клеточной популяции 12,5±0,5 (8,3-13,4) 11,5±0,6 (7,5-12,5) 11,7±0,8 (8,1-13,1) 11,5±0,8 (8-14) Примечание. Статистическая значимость различий между наблюдаемыми больными по критерию U - Вилкоксона-Манна-Уитни: *p <0,05, **р <0,01; КОЕ-Ф - фибробластная колониеобразующая единица; МНК - мононуклеарные клетки; АММСК - аутологичные мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки. Рис. 1. Спонтанный синтез цитокинов (пг/мл) в культурах аутологичных мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток у больных циррозом печени аутоиммунной (I группа), вирусной (II группа) и алкогольной (III группа) этиологии; *p <0,05 в сравнении с I группой; #p <0,05 в сравнении со II группой больных; MIP - макрофагальный воспалительный протеин; MCP-1 - хемотаксический для макрофагов белок-1; IFN-γ - интерферон γ; IL - интерлейкин; МСР-1 - моноцитарный хемоаттрактантный протеин-1; bFGF - основной фактор роста фибробластов; G-CSF - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор; VEGF - фактор роста эндотелия сосудов; IGF-1 - инсулиноподобный фактор роста-1.

About the authors

B A Agaev

Azerbaijan Medical University, Baku, Azerbaijan

R M Agaev

Azerbaijan Medical University, Baku, Azerbaijan

A G Popandopulo

International cell culture center «Biostem», Donetsk, Ukraine

R E Dzhafarli

Azerbaijan Medical University, Baku, Azerbaijan

Email: dr-jafarli@mail.ru

References

Supplementary files