Relationship between basic dental polymethyl methacrylate polymer roughness and surface topography and microbial biofilm formation using different polishing techniques

Full Text

Известно, что микробный налёт (или биоплёнка) и его метаболическая активность во рту - первичные причины ряда инфекционных процессов, включая кариес зубов, воспалительные заболевания дёсен и поддерживающих структур зубов [1, 6]. Полость рта создаёт благоприятные условия для роста обширной и разнообразной популяции бактерий. Уникальность полости рта заключается в том, что это единственное место в организме, содержащее твёрдые, не обновляющиеся поверхности, пригодные для микробной колонизации. Они состоят из естественных тканей зуба, таких как эмаль, дентин, цемент корня, а также из различных материалов, включая полимерные и металлические ортопедические конструкции, применяемые в стоматологии [5]. По данным современной литературы, основные факторы, способствующие формированию биоплёнки, - шероховатость и рельеф поверхности, характер субстрата и распределение свободной энергии на поверхности материала. Было показано, что определённые виды бактерий при колонизации отдают предпочтение определённым частям зубов, например некоторые из них очень плотно связываются с цементом корня, другие - с эмалью, третьи - с определёнными видами реставрационных или протезных материалов [11, 12]. На первой стадии формирования налёта определяющими являются начальные взаимодействия между микроорганизмом и субстратом, то есть гидрофобные и электростатические взаимодействия [2, 8, 10]. В настоящее время накоплено достаточно большое количество результатов исследований, в которых описаны особенности формирования налёта на различных стоматологических материалах, таких как керамика, металлы, полимеры [5, 9]. Однако исследований в области базисных ортопедических пластмасс в доступной литературе не очень много, и они, как правило, не раскрывают физико-химические основы процесса формирования биоплёнки [1, 2]. Quirynen и соавт. [12] в исследованиях in vivo, а затем и в клинике показали, что шероховатость поверхности материала особенно важна для прикрепления бактерий, тогда как влияние свободной энергии поверхности менее существенно. Ряд других авторов показали, что шероховатость поверхности материалов гораздо существеннее влияет на накопление налёта, чем потенциально антибактериальные вещества (содержащие фтор, выделяющийся из этих материалов, или иные антибактериальные компоненты) [9, 11]. В.Н. Царёв и соавт. [5, 6] отмечают необходимость изучения двух принципиально различных по механизмам процессов, однако являющихся последовательными стадиями формирования биоплёнки на поверхности материалов, расположенных в полости рта, - адгезию и колонизацию. В литературе содержатся многочисленные сообщения об изучении адгезии грибов рода Candida к поверхности реставрационных материалов [8, 10], титановых [11] и акриловых протезов [1, 2, 6, 12]. Исследования в области изучения механизмов микробной колонизации полимеров показали, что микроскопическая картина адгезии Candida на акриловых протезах связана со скоплением дрожжевых клеток в результате действия силы поверхностного натяжения. Исследования были выполнены с референтными штаммами C. albicans GDH 2346 и С. albicans GRI 681. Использование сканирующей микроскопии, описанной авторами, позволило сосчитать однородно распределённые дрожжи, располагающиеся по ходу прозрачных акриловых полос. Используя эту методику, авторы стандартизировали количество клеток грибов, что позволило улучшить методику оценки сродства С. albicans к полимерным поверхностям и распространить её на исследование адгезии других микроорганизмов к относительно прозрачным материалам. Наиболее точными приборами для измерения шероховатости контактным методом и получения трёхмерного изображения служат атомно-силовые микроскопы [4, 7]. Особенности данных приборов - контроль высоты рельефа поверхности с большой точностью (менее 1,0 нм), высокое латеральное разрешение (менее 10,0 нм), высокое аспектное отношение (высокий угол заострения наконечника), возможность получения трёхмерного изображения поверхности. Трёхмерное изображение позволяет оценить сегментарность, анизотропию текстурированной поверхности [3], то есть имеет большую информативность, чем двухмерный профиль, измеряемый классическими профилометрами. Атомно-силовое микроскопическое изображение имеет большую наглядность, позволяет визуально отметить особенности рельефа, плохо поддающиеся анализу численными методами. Дальнейшей задачей, по мнению исследователей, является разработка моделей для изучения механизмов адгезии пародонтопатогенных бактерий к базисным материалам, предназначенным для протезирования, и комплексная оценка факторов, определяющих адгезию и колонизацию, с использованием современных методов изучения адгезии и колонизации микроорганизмов [1, 6, 9]. Целью нашего исследования было изучение основных параметров поверхности фрезерованного полиакрилового материала с помощью атомно-силовой микроскопии и первичной микробной адгезии бактерий пародонтопатогенной группы и грибов рода Candida с учётом способа полировки образцов. В данной работе для исследований методом атомно-силовой микроскопии использована зондовая нанолаборатория «Интегра Прима» (ЗАО «НТ-МДТ», Россия). Для получения изображения рельефа применяли метод полуконтактной сканирующей зондовой микроскопии [3]. Данный метод основан на взаимодействии с поверхностью, колеблющейся на резонансной частоте кантилевера, оснащённого лазерным лучом с частотой несколько сотен килогерц. При использовании данного метода контактное давление кантилевера на поверхность существенно меньше по сравнению с контактными методами. Это позволяет проводить измерения на мягких и легко разрушающихся материалах (табл. 1). В экспериментальной части нашей работы были использованы следующие образцы: 1 - фрезерованные, без полировки (контроль); 2 - полированные в установке «Эрго Бокс»; 3 - полированные в условиях зуботехнической лаборатории; 4 - полированные на стоматологической установке. Шероховатость поверхности - совокупность неровностей поверхности с относительно малыми шагами на базовой длине или площади. С учётом развития методов атомно-силовой микроскопии и новых возможностей приборов по прорисовке деталей рельефа на субмикрометровом масштабе применяли расчёт параметров шероховатости по атомно-силовому микроскопическому изображению с помощью формулы: Rz= 1/5 (hmax1+hmax2+hmax3+hmax4+hmax5-hmin1- -hmin2-hmin3-hmin4-hmin5), где Rz - высота неровностей профиля по выбранным точкам; hmax - максимальная высота профиля в пределах базовой линии; hmin - минимальная высота профиля в пределах базовой линии. Параметры шероховатости определяли по полученным изображениям поверхностей при размере поля микроскопии 50×50 мкм. Для параллельного изучения первичной адгезии микроорганизмов (специфического прилипания к поверхности конструкционного материала для последующей колонизации и формирования биоплёнки) из исследуемого стоматологического материала - базисного полиметилметакрилатного полимера - мы изготавливали пластины площадью 0,25 см2, которые подвергали различным типам полировки с последующей отмывкой в дистиллированной воде. До постановки теста первичной адгезии образцы обрабатывали ультрафиолетовым излучением и хранили в стерильных чашках Петри. Для постановки эксперимента моделирования первичной адгезии микроорганизмов к образцам материала полиметилметакрилатного полимера мы использовали штаммы, относящиеся к пародонтопатогенным видам, которые были выделены из пародонтальных карманов у больных пародонтитом: Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus sanguis, а также грибов Candida albicans. Все исследования были выполнены нами в бактериологической лаборатории кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии Московского государственного медико-стоматологического университета им. А.И. Евдокимова (разрешение главного государственного санитарного врача №77.01.16.000.М.015177.11.09, г. Москва, от 18.11.2009). Идентификацию выделенных штаммов проводили с использованием протокола, рекомендованного для анаэробной бактериологической лаборатории, с применением тест-систем для идентификации анаэробных и микроаэрофильных бактерий по биохимическим свойствам API 20 A и API 20 Strep фирмы «БиоМерье» (Франция), а также по генетическим маркёрам с помощью полимеразной цепной реакции [5, 6]. Для проведения методики оценки первичной адгезии идентичные исследуемые образцы базисного стоматологического полиметилметакрилатного полимера размером 0,5×0,5 см помещали во взвесь суточной культуры микроорганизмов тест-штаммов. Количество бактерий в 1 мл взвеси составляло 108 колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) в соответствии со стандартом мутности 0,5 McFarland; грибов - 106 КОЕ/мл. Экспозиция - 40 мин в анаэростате при 37 °C для анаэробных бактерий, а для грибов - в обычных условиях при комнатной температуре. Процедура постановки эксперимента соответствовала стандартному методу [1, 2] с незначительными модификациями, которые заключались в следующем. Для удаления не прилипших бактерий или дрожжей сначала образцы трижды отмывали в 10 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. Затем каждый образец помещали в отдельную пластиковую камеру, содержащую 1 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. Далее пластиковые камеры с исследуемыми образцами обрабатывали ультразвуком в ультразвуковой ванне «Ultrаsoniс» (НПФ «Геософт», Россия) при частоте 60 кГц в течение 10 мин, что позволяло «снять» и перевести во взвешенное состояние те микробные клетки, которые вступили в первичную адгезию с поверхностью стоматологического материала. Затем из полученного смыва с образцов с помощью автоматической микропипетки проводили посев 100 мкл на 5% кровяной гемин-агар Columbia с последующим распределением микроорганизмов по поверхности питательной среды стерильной платиновой бактериологической петлёй. Для исследования адгезии дрожжевых грибов использовали агар Сабуро. Посевы инкубировали в анаэробных условиях при 37 °C для анаэробных бактерий и в обычных условиях при комнатной температуре - для грибов Candida albicans. После завершения культивирования с помощью исследовательского стереомикроскопа «Eclips» («Nikon», Япония) подсчитывали количество колоний, выросших на питательных средах, определяли десятичный логарифм этой величины и рассчитывали индекс первичной адгезии для каждого образца материала и исследуемых тест-штаммов по формуле, предложенной В.Н. Царёвым (2009) [6]: Ia=IgA/IgN, где Ia - индекс первичной адгезии; A - число прилипших бактерий; N - количество бактерий смыва. Статистическую обработку данных осуществляли методами вариационной параметрической и непараметрической статистики для малой выборки с использованием программы «Биостат» для персонального компьютера. Сводные результаты по измерению шероховатости поверхности четырёх образцов исследуемого материала с применением атомно-силовой микроскопии приведены в табл. 2. С помощью атомно-силовой микроскопии установлено, что полированные образцы имеют на порядок меньшую шероховатость, чем образцы после фрезеровки. Поверхность всех образцов неоднородна, параметры шероховатости поверхности на различных участках образца могут сильно отличаться, что отражается в стандартном отклонении. На образцах после фрезеровки присутствуют неровности с определённым направлением, которое задаётся алгоритмом обработки образца и формой рабочей части фрезы. На полированных образцах на поверхности имеются неровности в виде выступающих частиц, которые могут быть связаны с плохим отводом продуктов износа при полировке или прилипанием частиц полировочной смеси к образцу. Наличие данных частиц приводит к увеличению разницы между среднеарифметической и среднеквадратичной шероховатостью. Более детальное изучение образцов при атомно-силовой микроскопии показало, что в образцах с «обычной» фрезеровкой (рис. 1А*, 2А*, 3А) присутствуют глубокие канавки глубиной порядка 10 мкм и шагом около 100 мкм. Поверхность канавки на дне и на склоне имеет микрорельеф с невысокой шероховатостью. Микрорельеф состоит из неровностей, которые имеют то же направление, что и канавка. Вероятно, эти неровности отражают форму фрезы, использованной для данного образца. Параметры шероховатости: Ra=1270±820 нм, Rms=1480±880 нм, Rz=3830±1140 нм, где: - Ra (average roughness) - средняя арифметическая шероховатость, измеряется в метрах и определяется как среднее отклонение всех точек атомно-силового изображения от средней плоскости в соответствии со следующим выражением; - Rms (root mean square roughness) - средняя квадратичная шероховатость, измеряется в метрах и определяется как среднее значение измеренных отклонений от средней плоскости; - Rz (ten point height) измеряется в метрах и выражает шероховатость поверхности по выбранным пяти максимальным высотам и впадинам. Вероятно, дополнительная финишная полировка поверхности может значительно уменьшить измеряемую шероховатость образцов за счёт удаления выступов, представляющих собой одиночные частицы или их агломераты. Очевидно, что все эти факторы могут влиять на уровень первичной адгезии микроорганизмов при их контакте с данным видом базисной пластмассы, последующее формирование микробной биоплёнки в клинических условиях и её «агрессивность» для слизистой оболочки рта и пародонта. Полученные нами цифровые данные, характеризующие первичную адгезию представителей пародонтопатогенной микрофлоры полости рта и дрожжевых грибов к образцам стоматологического материала с разными типами полировки, представлены в табл. 3. Как видно из представленных данных, для базисного стоматологического полиметилметакрилатного полимера отмечались принципиальные различия первичной адгезии бактериальной (Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus sanguis) и грибковой (Candida albicans) микрофлоры, в том числе и в зависимости от способа полировки. В целом индексы адгезии к контрольным образцам после «обычной» фрезеровки соответствовали среднему уровню первичной адгезии, описанному ранее для анаэробных пародонтопатогенов (0,32-0,52) и дрожжевых грибов Candida albicans (0,59), и высокому уровню - для Streptococcus sanguis (0,94) [1, 2, 6]. Также были отмечены различия по способам полировки, и в ряде случаев они были статистически значимы, что соответствовало результатам, полученным с помощью атомно-силовой микроскопии. Хотя мы и наблюдали несколько иную картину в отношении образцов материала, обработанных разными способами (полированных), но общая закономерность, выявленная с контрольными образцами, сохранялась: более низкий уровень адгезии отмечен у штамма фузобактерий, средний (умеренный) - у Porphyromonas gingivalis и грибов Candida albicans, самый высокий - у микроаэрофильных стрептококков. Так, при исследовании адгезии тест-штаммов к образцам, полированным в установке «Эрго Бокс» (рис. 1Б*, 2Б*, 3Б), отмечен минимальный уровень первичной адгезии всех тест-штаммов, как бактерий, так и грибов, в пределах от 0,24 (фузобактерии) до 0,37 (Candida). Более высокий уровень первичной адгезии также продемонстрировали микроаэрофильные стрептококки (0,84±0,03, p <0,05) по сравнению как с контролем, так и с другими видами полировки). Параметры шероховатости: Ra=83±48 нм, Rms=114±59 нм, Rz=640± 280 нм. На образцах, полированных в установке «Эрго Бокс», не видно полос полировки, но имеются одиночные частицы подобно тем, что наблюдались на образцах, полированных в лаборатории (см. ниже). В отличие от образцов, полированных в лаборатории, таких частиц на поверхности меньше, и они менее склонны к образованию агломератов. В то же время рельеф поверхности полированных в установке «Эрго Бокс» образцов имеет несколько больший перепад высот по сравнению с рельефом образцов, полированных в лаборатории. Можно предположить, что более грубые частицы и зазубрины в условиях клинического применения материала с такой формой обработки способны стать хорошей основой для формирования массивной микробной биоплёнки, что может иметь отрицательное влияние на слизистую оболочку полости рта и пародонт. При исследовании адгезии тест-штаммов к образцам, полированным в зуботехнической лаборатории, отмеченная закономерность была аналогичной (рис. 1В*, 2В*, 3В). Индекс адгезии анаэробных микроорганизмов и грибов составил от 0,22 (фузобактерии) до 0,49 (Candida albicans). Более высокий уровень первичной адгезии продемонстрировали лишь микроаэрофильные стрептококки (0,90±0,04, p <0,05 по сравнению как с контролем, так и с другими видами полировки). Параметры шероховатости: Ra=76±47 нм, Rms=125±70 нм, Rz=920±380 нм. При атомно-силовой микроскопии отмечено, что на полированных образцах отсутствуют микронные неровности, характерные для фрезерованных образцов, то есть поверхность становится менее шероховатой. Однако на образцах, полированных в лаборатории, видны полосы от полировки глубиной в несколько десятков нанометров и шагом несколько микрометров. На поверхности присутствуют частицы, принимающие форму острых выступов-зазубрин на атомно-силовом микроскопическом изображении. Частицы собраны в агломераты и неоднородно распределены по поверхности образца. Данные частицы могут быть продуктами износа материала образца или частицами полировочной смеси. Такие частицы часто имеют невысокое сцепление с подложкой и легко отделяются от поверхности при слабом механическом взаимодействии. Последнее объясняет, почему степень адгезии к образцам, полированным в лаборатории, была несколько выше по сравнению с образцами, полированными в «Эрго Бокс», где сцепление частиц и зазубрин более выражено: большое количество микробных клеток, прилипших к зазубринам, отделяется от образцов вместе с ними при проведении посева на питательную среду. Это несколько повышает показатель адгезии по сравнению с обработкой в установке «Эрго Бокс». Возможно, данным образцам следует провести дополнительную финишную очистку поверхности после полировки, которая устранит эти неровности. Способ и параметры такой процедуры следует подбирать после анализа состава и механических свойств данных частиц. При исследовании адгезии тест-штаммов к образцам, полированным в условиях стоматологического кабинета, отмечены наименее выраженные отличия от контрольных фрезерованных образцов (рис. 1Г*, 2Г*, 3Г). Параметры шероховатости: Ra=110±64 нм, Rms=166±88 нм, Rz=990±600 нм. Так, только у фузобактерий адгезия была низкой (0,28). Индекс адгезии анаэробов и грибов был умеренным и составил от 0,45 (Porphyromonas gingivalis) до 0,51 (Candida albicans). Уровень адгезии микроаэрофильных стрептококков вообще был крайне высоким и не отличался от контрольных (неполированных) образцов (0,94+0,04, p >0,05). На образцах, полированных на стоматологической установке, не видно полос полировки, присутствуют одиночные частицы подобно тем, что наблюдались на всех полированных образцах. Значительных агломератов не наблюдается. Перепад высот неровностей на поверхности образцов достигает сотни нанометров, что является наибольшим значением среди полированных образцов. Описанная микроскопическая картина может привести к формированию массивной биоплёнки в клинических условиях и обусловить повреждение слизистой оболочки полости рта и пародонта токсинами и ферментами пародонтопатогенных бактерий и грибов рода Candida [1, 2, 6]. Таким образом, полученные данные позволяют сделать заключение, что образцы из полиметилметакрилатного полимера для изготовления базисов протезов обладают различной степенью выраженности микробной адгезии представителей пародонтопатогенной микрофлоры и грибов рода Candida, которая зависит от способа полировки, что соответственно определяет различия колонизационной резистентности к формированию микробной биоплёнки при использовании полимера в клинических условиях. ВЫВОДЫ 1. Шероховатость поверхности стоматологического базисного полиметилметакрилатного полимера, рельеф поверхности, наличие конгломератов материала и зазубрин, а также степень их сцепления с материалом, используемым для зубного протезирования, имеют существенное значение в формировании биоплёнки на данных материалах с участием резидентных (Streptococcus sanguis) и пародонтопатогенных (Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum) видов анаэробных бактерий, а также и дрожжевых грибов Candida albicans, что позволяет обосновать выбор определённых способов полировки. 2. Образцы полимерного материала, полученные при обработке в установке «Эрго Бокс» и зуботехнической лаборатории, характеризуются минимальным уровнем адгезии по сравнению с другими способами, что позволяет сделать заключение о том, что полиметилметакрилатный полимер, обработанный данным способом, обладает более выраженной колонизационной резистентностью в отношении штаммов пародонтопатогенных бактерий и грибов. Средние значения колонизационной резистентности имеет образец полиметилметакрилатного полимера, обработанный на стоматологической установке, а минимальные - неполированные. 3. Наиболее высокий уровень адгезии к базисному стоматологическому полиметилметакрилатному полимеру отмечен у штамма Streptococcus sanguis: достоверное снижение индекса адгезии отмечено только при использовании полировки в установке «Эрго Бокс». Однако факт высокой колонизации образцов Streptococcus sanguis нельзя однозначно считать отрицательным, поскольку этот микроорганизм - представитель нормальной микробной флоры полости рта в отличие от других видов, использованных для исследования первичной адгезии в настоящей работе. Таблица 1 Основные характеристики зондового атомно-силового микроскопа и режимов работы при проведении эксперимента Размер образца До 100 мм в диаметре и 15 мм в высоту Масса образца До 300 г XY-позиционирование образца 5×5 мм Поле сканирования (X×Y×Z) 100×100×10 мкм Нелинейность, XY(с датчиками обратной связи) 0,15% Уровень шума, Z (СКО в полосе 1000 Гц) От 0,06 нм (типично) до 0,07 нм Уровень шума, XY (СКО в полосе 200 Гц) От 0,1 нм (типично) до 0,2 нм Примечание: СКО - среднее квадратичное отклонение. Таблица 2 Параметры шероховатости поверхности образцов полиметилметакрилата с разными способами полировки Параметры После фрезерования (контроль) Полировка Лаборатория Установка «Эрго Бокс» Стоматологическая установка Ra, нм 1270±820 76±47* 83±48* 110±64* Rms, нм 1480±880 125±70* 114±59* 166±88* Rz, нм 3830±1140 920±380* 640±280* 990±600* Примечание. В таблице указаны средние значения и после символа ± - стандартное отклонение для данного значения. *Различия статистически значимы по сравнению с «контролем» (p <0,05), различий по прочим группам нет. Ra (average roughness) - средняя арифметическая шероховатость; Rms (root mean square roughness) - средняя квадратичная шероховатость; Rz (ten point height) - шероховатость поверхности по выбранным пяти максимальным высотам и впадинам. Рис. 3. Профиль сечения рельефа поверхности образцов: А - после «обычной» фрезеровки; Б - после полировки в установке «Эрго Бокс» (параметры шероховатости: Ra=83±48 нм, Rms=114±59 нм, Rz=640±280 нм); В - после полировки в зуботехнической лаборатории (параметры шероховатости: Ra=76±47 нм, Rms=125±70 нм, Rz=920±380 нм); Г - после полировки на стоматологической установке (параметры шероховатости: Ra=110±64 нм, Rms=166±88 нм, Rz=990±600 нм). * Рис. 1 и 2 см. на обложке. Graf_1.tif Таблица 3 Результаты исследования адгезии к исследуемым образцам in vitro представителей бактериальной флоры и грибов Candida albicans Образцы, полированные Porphyromonas gingivalis Fusobacterium nucleatum Streptococcus sanguis Candida albicans в установке «Эрго Бокс» 0,37±0,02** 0,24±0,02** 0,84±0,03* 0,39±0,03** в зуботехнической лаборатории 0,43±0,03* 0,22±0,02** 0,90±0,04 0,49±0,03* на стоматологической установке 0,45±0,03* 0,28±0,02* 0,93±0,04 0,51±0,03* Контроль (фреза, без полировки) 0,52±0,02 0,32±0,02* 0,94±0,04 0,59±0,03 Примечание: *показатель адгезии статистически значимо ниже по сравнению с контрольными образцами (p <0,05); **показатель адгезии статистически значимо ниже по сравнению с другими опытными образцами (p <0,05).

About the authors

S D Arutyunov

Moscow State University of Medicine and Dentistry named after A.I. Evdokimov, Moscow, Russia

E V Ippolitov

Moscow State University of Medicine and Dentistry named after A.I. Evdokimov, Moscow, Russia

A A Pivovarov

Moscow State University of Medicine and Dentistry named after A.I. Evdokimov, Moscow, Russia

Email: Anton_pivovarov@bk.ru

V N Tsarev

Moscow State University of Medicine and Dentistry named after A.I. Evdokimov, Moscow, Russia

References

Supplementary files