Functional and metabolic neutrophils activity in patients with acute intestinal infections and the influence of selimakcid

Full Text

В структуре инфекционной заболеваемости острые кишечные инфекции (ОКИ) занимают второе место по распространённости. Этиологически подавляющее большинство ОКИ - шигеллёзы и сальмонеллёзы, заболеваемость которыми остаётся высокой среди всех возрастных групп и имеет неуклонную тенденцию к росту во многих странах мира, включая Россию. Социально-экономическая значимость этих инфекций определяется не только высокой заболеваемостью, временной потерей трудоспособности, но и тяжестью течения с летальностью до 4,3-7,4%, формированием бактерионосительства [2, 4, 5]. Сложность решения задач по снижению заболеваемости сальмонеллёзом и шигеллёзом связана, с одной стороны, с отсутствием средств специфической профилактики, а с другой - с постоянным изменением спектра патогенности возбудителей с возможностью смены их пейзажа за счёт завоза новых сероваров. Формирование множественной лекарственной устойчивости данных бактерий к средствам этиотропной терапии приводит к неэффективности ранее широко применяемых в клинической практике антибактериальных препаратов [1, 8]. В литературе представлено много данных о нарушениях иммунитета при инфекционных заболеваниях, в том числе и при сальмонеллёзе и шигеллёзе. Кроме того, широко применяемые с целью этиотропной терапии антимикробные препараты могут снижать иммунобиологическую реактивность организма и функциональную активность иммунокомпетентных клеток [7]. Эти обстоятельства подчёркивают актуальность поиска новых антимикробных препаратов, сочетающих высокую активность в отношении резистентных штаммов микроорганизмов и не оказывающих отрицательного влияния на иммунореактивность и систему гемостаза. В этом плане наше внимание привлёк новый отечественный препарат, синтезированный сотрудниками Института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова г. Казани, - диэтиламмониевая соль N-метиламино-1-фенилметансульфоновой кислоты, или селимакцид [3]. Селимакцид обладает стабильной бактерицидной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе сальмонелл и шигелл. В первоначальных опытах на здоровых лабораторных животных было установлено, что селимакцид не оказывает отрицательного влияния на их клиническое состояние, некоторые гематологические показатели, протеинограмму и достоверно повышает фагоцитарную активность лейкоцитов и бактерицидные свойства сыворотки крови. Актуальность наших изысканий подчёркивается и тем, что антимикробные препараты, способные вызывать иммуносупрессию, должны отсеиваться на стадии доклинических испытаний [7]. Эффективность антимикробной терапии находится в самой тесной зависимости от состояния иммунной системы. В комплексе защитных механизмов определённая роль принадлежит фагоцитозу - одному из факторов естественного иммунитета, поэтому оценка его занимает серьёзное место в характеристике реактивного состояния организма при ОКИ. Важным показателем неспецифической резистентности организма служит функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов, ответственных за процесс фагоцитоза и внутриклеточное переваривание микроорганизмов. В связи с этим большое значение приобрело изучение функционально-метаболической активности нейтрофилов с помощью реакции с нитросиним тетразолием (НСТ-тест), имеющей общие закономерности с процессом фагоцитоза и раскрывающей его биохимические основы. Этот тест характеризует функциональный резерв нейтрофилов и их способность отвечать респираторным взрывом на адекватное раздражение [6, 9]. Одновременно нами использован относительно новый перспективный и более объективный метод «BURSTTEST» - тест для количественного определения респираторного взрыва в гранулоцитах с учётом процентного содержания клеток, продуцирующих реактивные оксиданты, с помощью проточной цитофлюориметрии. Цель исследования - выяснить состояние функциональной активности нейтрофилов у здоровых, а также у больных сальмонеллёзом и шигеллёзом в остром периоде заболевания и влияние на неё селимакцида in vitro. Были обследованы 48 больных средней степени тяжести с диагнозами: «Сальмонеллёз, гастроинтестинальная форма» и «Острая дизентерия» в возрасте от 20 до 60 лет. Контрольную группу составили 10 практически здоровых людей того же возраста. Функционально-метаболическую активность нейтрофилов изучали в спонтанном и индуцированном вариантах НСТ-теста по методу B.H. Park и соавт. в модификации М.Е. Виксмана и А.Н. Маянского, а также в реакции «BURSTTEST» («ORPEGEN Pharma») в нашей модификации. Для исследования осуществляли забор венозной крови из локтевой вены утром натощак у клинически здоровых людей и в первые сутки поступления больного с ОКИ (дизентерией или сальмонеллёзом) до начала комплексного лечения. В работе использовали гепаринизированную кровь: 15-20 ЕД гепарина на 1 мл крови. И в НСТ-тесте, и в реакции «BURSTTEST» в пробирки для исследования вносили по 50 мкл крови. В НСТ-тесте в опытных сериях селимакцид добавляли в конечной концентрации: в I пробирку - 5 мг/мл, во II - 1 мг/мл, в III - 0,5 мг/мл, в IV - 0,1 мг/мл, в контроле вместо препарата использовали 0,9% раствор натрия хлорида. Пробы крови инкубировали в течение 30 мин при температуре 37 °С. Затем в спонтанном НСТ-тесте добавляли 25 мкл 0,9% раствора натрия хлорида, а в индуцированном - 25 мкл вакцины Serratia marcescens (2 млрд м.т./мл, Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии). При подготовке к проведению реакции «BURSTTEST» пробирки FALKON с 50 мкл исследуемой крови помещали на 10 мин на «ледяную баню». Затем для активации в одну пробирку добавляли опсонизированные E. coli (10 мкл), в другую - Sol. washing (отмывающий раствор, 10 мкл, отрицательный контроль) и инкубировали 10 мин при температуре 37 °С. Следующим этапом для мониторирования образования реактивных оксидантов в каждую пробирку прибавляли 10 мкл дигидрородамина 123 (субстратный раствор), инкубация при температуре 37 °С происходила в течение 10 мин. Для остановки реакции оксидации субстратного раствора, лизиса эритроцитов и частичной фиксации лейкоцитов добавляют 1 мл лизирующего раствора (3 мин). Затем центрифугируют 5 мин при 1500 об./мин при температуре 4 °С, удаляют надосадочную жидкость, добавляют 1,5 мл Sol. washing, охлаждённый до 0 °С, и вновь центрифугируют 5 мин при 1500 об./мин и температуре 4 °С. После повторного удаления надосадочной жидкости к осадку добавляют 100 мкл красящего раствора DNA с инкубацией в течение 10 мин при 0 °С. Наша модификация реакции «BURSTTEST» заключалась в том, что мы добавляли селимакцид в вышеуказанных концентрациях (пробирки №3, 4, 5, 6), в качестве контроля без препара-та - 10 мкл 0,9% раствора натрия хлорида (пробирка №2) и инкубировали при температуре 37 °С в течение 30 мин. Кровь в первой пробирке охлаждали на «ледяной бане» 10 мин, затем добавляли 10 мкл Sol. washing - отрицательный контроль. После инкубации в пробирки №2, 3, 4, 5 и 6 вносили 25 мкл вакцины Serratia marcescens и помещали в термостат на 10 мин. После этого добавляли субстратный раствор и следовали методике. Учёт результатов проводили на проточном цитофлюориметре в программе Cell Quest. Статистическую обработку полученных данных проводили общепринятыми методами вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента. У больных сальмонеллёзом и шигеллёзом средней степени тяжести отмечалось статистически значимое повышение функционально-метаболической активности нейтрофилов в спонтанном НСТ-тесте в остром периоде заболевания по сравнению с показателем у здоровых (табл. 1). Подобная динамика процесса была обнаружена и при изучении стимулированной Serratia marcescens активности клеток у больных с острой дизентерией. Однако у больных сальмонеллёзом показатели индуцированного НСТ-теста не отличались от уровня здоровых людей (p >0,05). Резервная реактивность нейтрофилов (разница между показателями спонтанного и индуцированного НСТ-теста), отражающая эффекторный потенциал системы фагоцитоза, в остром периоде сальмонеллёза и шигеллёза была ниже, чем у здоровых людей. Процентное содержание нейтрофилов, продуцирующих реактивные оксиданты, регистрируемое при проточной цитофлюориметрии в реакции «BURSTTEST» у больных сальмонеллёзом и дизентерией, совпадало с показателями индуцированного НСТ-теста (p >0,05) и не различалось по нозологиям (p >0,05). Изучение воздействия селимакцида на функциональную активность нейтрофилов у здоровых (табл. 2) и больных сальмонеллёзом и шигеллёзом (табл. 3) в НСТ-тесте показало, что препарат не оказывал статистически значимого влияния на спонтанную метаболическую активность нейтрофильных гранулоцитов (р >0,05). В индуцированном НСТ-тесте мы выявили, что прединкубация нейтрофилов с селимакцидом вызывает усиление их ответа на воздействие Serratia marcescens. Так, нейтрофилы больных ОКИ в индуцированном НСТ-тесте отвечали увеличением активности на дозы селимакцида 0,1; 0,5 и 1 мг/мл (р <0,01), а у здоровых доноров - на дозы 0,1 и 0,5 мг/мл (р <0,05). Способность препарата модулировать активность нейтрофилов у больных сальмонеллёзом и дизентерией оказалась выше, чем у здоровых людей (p <0,05; p <0,01). Подтверждение способности селимакцида изменять готовность нейтрофилов к активации у больных ОКИ мы обнаружили и при количественном определении так называемого респираторного взрыва при проточной цитометрии в реакции «BURSTTEST» (табл. 4). Данные, полученные при цитофлюориметрии, совпадают с результатами индуцированного НСТ-теста, то есть селимакцид потенцирует способность нейтрофилов отвечать на воздействие в дозах 0,1; 0,5 и 1 мг/мл (р <0,01; р <0,05). На рис. 1 представлены цитограммы больного 27 лет с диагнозом: «Сальмонеллёз, гастроинтестинальная форма, гастроэнтеритический вариант, средняя степень тяжести». В общем анализе крови - лейкоцитоз, умеренный нейтрофилёз, сдвиг лейкоцитарной формулы влево. При бактериологическом исследовании кала выделена культура S. enteritidis биовар jena. Из эпидемиологического анамнеза: характер заболевания групповой, после совместного употребления яичницы заболели, кроме данного больного, его сожительница и трое её детей, которые с подобной же симптоматикой были госпитализированы в детскую инфекционную больницу. Активность нейтрофилов под влиянием селимакцида в концентрациях 0,1; 0,5; 1 и 5 мг/мл увеличилась на 7-14%. Таким образом, селимакцид не только не оказывал отрицательного воздействия на неспецифическую резистентность организма, но и проявлял иммуномодулирующие свойства. ВЫВОДЫ 1. Для выяснения состояния фагоцитарных механизмов защиты при острых кишечных инфекциях бактериальной этиологии существенным показателем служит определение функциональной активности нейтрофилов в реакции «BURSTTEST». Это объективная количественная оценка так называемого респираторного взрыва, что особенно важно при сравнении результатов в динамике инфекционного процесса. 2. У больных сальмонеллёзом и шигеллёзом средней степени тяжести в остром периоде болезни происходит повышение функционально-метаболической активности нейтрофилов с истощением их резервного потенциала, что подтверждается при оценке как в тесте с нитросиним тетразолием, так и в тесте «BURSTTEST», причём последний имеет преимущество по количественному определению респираторного взрыва в гранулоцитах. 3. Селимакцид проявляет иммуномодулирующее действие, повышая in vitro (тест с нитросиним тетразолием и «BURSTTEST») функционально-метаболический потенциал нейтрофилов у больных сальмонеллёзом и шигеллёзом. Таблица 1 Функционально-метаболическая активность нейтрофилов у больных сальмонеллёзом и дизентерией Показатель, % Здоровые, n=10 При сальмонеллёзе, n=16 При дизентерии, n=17 p3-4 1 2 3 4 5 Спонтанный тест с нитросиним тетразолием 6,8±0,51 26,0±0,52* 30,45±1,17* <0,01 Индуцированный тест с нитросиним тетразолием 42,2±1,13 43,43±0,84 48,55±1,1* <0,01 Резерв реактивности нейтрофилов 35,4±1,23 17,43±0,68* 18,1±1,12* >0,05 BURSTTEST 45,3±4,2 42,44±5,54 44,2±4,1 >0,05 Примечание: *статистическая значимость различий с уровнем здоровых лиц (p <0,01); p3-4 - статистическая значимость различий показателя между нозологиями. Таблица 2 Показатели функциональной активности нейтрофилов у клинически здоровых людей при воздействии селимакцида в НСТ-тесте (n=10) НСТ-тест, % Контроль без препарата Доза селимакцида, мг/мл 5 1 0,5 0,1 Спонтанный 6,8±0,51 8,2±0,62 7,8±0,72 7,6±0,62 8,3±0,62 Индуцированный 42,2±1,13 43,5±1,54 45,3±1,95 46,5±1,54* 47,5±1,44* Примечание: НСТ-тест - тест с нитросиним тетразолием; *статистическая значимость различий по сравнению с контролем (p <0,05). Таблица 3 Показатели функциональной активности нейтрофилов у больных шигеллёзом и сальмонеллёзом при воздействии селимакцида в НСТ-тесте (n=18) НСТ-тест, % Контроль без препарата Доза селимакцида, мг/мл 5 1 0,5 0,1 Спонтанный 28,7±1,23 30,1±1,62 31,2±1,68 33,2±2,07 32±2,98 Индуцированный 46,6±1,421 51,7±2,271 53,8±1,55*1 52,4±1,49*1 53,2±1,36*1 Примечание: НСТ-тест - тест с нитросиним тетразолием; *статистическая значимость различий с контролем (p <0,01); 1статистическая значимость различий с уровнем здоровых. Таблица 4 Функциональная активность нейтрофилов у больных шигеллёзом и сальмонеллёзом при воздействии селимакцида в реакции «BURSTTEST» (n=15) Контроль без препарата Доза селимакцида, мг/мл 5 1 0,5 0,1 «BURSTTEST», % 41,0±4,5 50,73±4,6 55,47±4,6** 62,47±5,1* 58,8±4,6** Примечание: *р <0,01; **р <0,05. Рис. 1. Влияние селимакцида на функционально-метаболическую активность нейтрофилов больного сальмонеллёзом в реакции «BURSTTEST»: а - пул регистрируемых клеток; б - отрицательный контроль; в - контроль (вместо препарата - 0,9% раствор натрия хлорида); г - влияние селимакцида в концентрации 0,1 мг/мл; д - влияние селимакцида в концентрации 0,5 мг/мл; е - влияние селимакцида в концентрации 1 мг/мл; ж - влияние селимакцида в концентрации 5 мг/мл.

About the authors

G Kh Murtazina

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

Email: murtaza07@mail.ru

V Kh Fazylov

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

A V Ivanov

Federal Center of Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan, Russia

References

Supplementary files