Clinical course of neurological disorders in experimental hemorrhagic stroke after treatment with interleukin-2 (ronkoleukinum)

Cover Page

Abstract


Aim. To study the influence of recombinant interleukin-2 (Ronkoleukinum) on indicators of oxidative protein modification and severity of neurologic signs in rats with experimental hemorrhagic stroke. Methods. Oxidative protein modification (by aldehyde and carboxyl products), the survival rate, neurological deficit by McGrow Stroke-index and animal psychophysiological status were studied on the model of intracerebral hemorrhage in rats after treatment with 0.01 mg/kg of interleukin-2 (Ronkoleukinum). Results. The progression of experimental hemorrhagic stroke in rats was accompanied with typical pathophysiological signs - oxidative protein modification with following neurological and cognitive disorders, followed by death of experimental animals. Administration of interleukin-2 (Ronkoleukinum) 0.01 mg/kg hampered the processes of free radical proteins damage, therefore decreasing the mortality rate in animals with intracerebral hemorrhage. Animals that were administered interleukin-2 (Ronkoleukinum) died only during the first 24 hours after the stroke, with mortality rate significantly lower compared to controls starting form the 4th day of the experiment (р <0.05). The use of interleukin-2 (Ronkoleukinum) also statistically significantly decreased the severity of post-ischemic behavioral, neurological and cognitive disorders, improving the movement activity, psychoneurological status assessed by McGrow scale, stabilizing the memory and passive avoidance reflex recovery. Conclusion: interleukin-2 (Ronkoleukinum) can effectively prevent the formation of post-stroke neuronal disorders, so its use as a nosotropic nootropic agent seems to have a good perspective.

Full Text

Геморрагический инсульт (ГИ) - наиболее тяжёлая форма острого нарушения мозгового кровообращения. В последние десятилетия отмечен рост показателей его распространённости, в том числе среди лиц трудоспособного возраста, и тяжести. После ГИ выраженность нейродегенеративных изменений в пострадавшей области мозга уменьшается от центра к периферическим зонам пенумбры. Формирование окончательных размеров инфаркта мозга и последующих нейрональных потерь происходит в течение 3-5 сут с момента заболевания [11]. Следовательно, актуальным остаётся поиск новых средств фармакологической защиты мозга для эффективной коррекции неврологических нарушений [3, 5]. Первично при ГИ происходит поражение отдельных сверхчувствительных к ишемии нейронов, в дальнейшем вокруг геморрагического очага развивается вторичное повреждение как результат реакций локального воспаления, инициированных микроглией [13]. При этом отмечают значительное повышение уровней провоспалительных факторов, в том числе цитокинов - интерлейкинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8) и фактора некроза опухоли альфа (ФНОα) [12, 14]. Первым в зоне ишемии продуцируется ИЛ-1, который также стимулирует синтез секретируемых Т-хелперами ростовых факторов - ИЛ-2 и ИЛ-4 [9, 13]. ИЛ-2 участвует в формировании быстрого иммунного ответа - индуцирует пролиферацию В-лимфоцитов, активирует цитотоксические Т-лимфоциты [10, 14]. В клинической практике рекомбинантный ИЛ-2 (ронколейкин) используют для коррекции вторичной иммунной недостаточности - в комплексной терапии гнойно-воспалительных заболеваний и онкологических процессов [7]. Учитывая, что формирование нейродегенеративных изменений в зоне ГИ связано с «цитокиновым каскадом», в настоящей работе поставлена цель изучить взаимосвязь между эффектами рекомбинантного ИЛ-2 (ронколейкина), окислительным повреждением белков и выраженностью неврологических нарушений у крыс с экспериментальным ГИ. Исследования проводили на белых нелинейных крысах с массой тела 170-200 г. Внутримозговое кровоизлияние (ВМК) вызывали введением аутокрови во внутреннюю капсулу головного мозга под этаминал-натриевым наркозом (40 мг/кг). Животные были разделены на три группы по 20 крыс: первая группа - ложнооперированные животные (ЛО), которым в соответствии с методикой воспроизведения ВМК производили забор аутокрови из хвостовой вены без её введения во внутреннюю капсулу, вторая - животные с ВМК (контрольная патология - группа КП), третья - животные с патологией, которым ИЛ-2 (ронколейкин) в дозе 0,01 мг/кг (группа Р) вводили внутримышечно сразу после выхода животных из наркоза и в дальнейшем 1 раз в сутки в течение 18 дней. По истечении острого периода ишемии (4 дня) и фазы восстановления (18 дней) в гомогенате мозга биохимическими методами определяли содержание ранних [по уровню альдегидфенилгидразонов (АФГ)] и поздних [по уровню карбоксилфенилгидразонов (КФГ)] маркёров окислительной модификации белка. Для этого на 4-е и 18-е сутки исследования часть животных (половину голов в каждой группе) выводили из эксперимента путём декапитации под эфирным наркозом с целью получения биологического материала для проведения биохимических исследований. Также оценивали выживаемость крыс и динамику постишемических нарушений - на 4-е и 18-е сутки регистрировали неврологический дефицит по шкале Stroke-index McGrow (тяжесть состояния определяли по сумме соответствующих баллов) и ориентировочно-исследовательское поведение крыс (в условиях методики открытого поля - в течение 3 мин регистрировали горизонтальные и вертикальные перемещения, обследование отверстий). Обучение условному рефлексу пассивного избегания проводили по стандартной методике в восстановительном периоде ВМК (18-е сутки). Полученные результаты проанализированы с использованием t-критерия Стьюдента, U-параметра Манна-Уитни и критерия χ2. Статистически значимыми считали различия с уровнем значимости более 95% (р <0,05), которые отмечали как рЛО (относительно ложнооперированных животных) или рКП (относительно контроля). В ходе эксперимента в течение 7 сут после ВМК в группе ЛО гибели животных не наблюдали. В контрольной группе случаи гибели крыс происходили до 4-х суток включительно (рис. 1), показатель летальности увеличился с 50% в 1-3-и сутки до 70% на 4-7-е сутки. Гибель животных, получавших ИЛ-2 (ронколейкин), наблюдалась только в 1-е сутки, показатель выживаемости значимо отличался от группы КП, начиная с 4-х суток эксперимента (рКП <0,05). Снижение поступления молекулярного кислорода в нейроны стимулирует образование активных форм кислорода, которые обладают высокой реакционной способностью и потенциально опасны для клеточных структур. Окислительный стресс развивается в условиях резкой активации окислительных процессов при недостаточной эффективности антиоксидантной защиты. Образовавшиеся при церебральной ишемии повышенные уровни активных форм кислорода инициируют прямую деструкцию нуклеиновых кислот и вызывают окислительную модификацию белка [4], стимулируют синтез провоспалительных цитокинов и формируют порочный круг вторичных повреждений [9, 15]. ВМК у экспериментальных животных на протяжении всего эксперимента сопровождалось повышенным содержанием показателей окислительной модификации белка - уровень раннего (АФГ) и позднего (КФГ) маркёров был повышен соответственно в 5,3 и 4,5 раза на 4-е сутки и в 5,5 и 5 раз на 18-е сутки наблюдения (рЛО <0,01, табл. 1). Применение ИЛ-2 (ронколейкина) привело к торможению процессов свободнорадикального повреждения белков - показатели окислительной модификации белка к 18-м суткам были на 56-70% ниже уровней контроля (рКП <0,01). При ВМК происходят последовательные процессы микроциркуляторно-клеточного каскада - снижение мозгового кровотока приводит к максимуму энергетического дефицита, развивается глутаматная эксайтотоксичность, происходит массивное внутриклеточное поступление ионов натрия и кальция, что стимулирует активацию фосфолипаз и протеиназ с образованием цитокинов и оказывает негативное воздействие на межклеточные структуры, окружающие клеточные мембраны и сосудистую стенку. Это способствует формированию цитотоксического отёка глии и нейронов, проникновению токсических веществ из сосудистого русла в мозговую ткань на фоне продолжающихся оксидантных и прокоагуляционных реакций и гибели жизненно важных нейронов с формированием неврологического дефицита [6]. Исследование неврологического статуса крыс по отдельным показателям шкалы McGrow показало, что у крыс группы ЛО тяжёлые неврологические нарушения в виде манежных движений, парезов и параличей не наблюдались. У большинства животных группы КП в остром и восстановительном периодах после ВМК неврологические нарушения были умеренно выраженными (вялость, замедленность движений, слабость конечностей, птоз) и тяжёлыми (манежные движения, парезы и параличи конечностей). Стабилизация ИЛ-2 (ронколейкином) неврологического статуса крыс после ВМК подтверждается существенным снижением частоты парезов и параличей конечностей, манежных движений (эффекты более выражены в периоде восстановления), а также снижением суммы баллов по шкале McGrow (рис. 2), которая в восстановительном периоде была значительно ниже и значимо отличалась от группы КП (pКП <0,01). В эксперименте ВМК привело к выраженному снижению ориентировочно-исследовательской и двигательной активности животных - у крыс группы КП (табл. 2) количество стоек, пересечённых квадратов и исследованных отверстий уменьшилось на 4-е сутки эксперимента на 80-94% по сравнению с группой ЛО (pЛО <0,001) с незначительной динамикой этих показателей к 18-м суткам эксперимента (pЛО <0,01). Активное восстановление показателей ориентировочно-исследовательского поведения происходило в группе животных, получавших ИЛ-2 (ронколейкин), - к 18-м суткам количество горизонтальных и вертикальных движений относительно КП увеличились соответственно на 48 и 61% (pКП <0,01), ориентировочно-исследовательская активность - на 33% (pКП <0,05), что также свидетельствует о стабилизации неврологического статуса. По сравнению с прочими элементами мозга, страдающими от ишемического воздействия, особую ранимость обнаруживают нейроны гиппокампа [15], которые участвуют в реализации процессов приобретения и консолидации следов памяти и организации ориентировочного рефлекса [8]. Фокальная или глобальная ишемия неизменно сопровождается поражениями гиппокампа и ведёт к когнитивной патологии [1, 2]. Данные проведённого эксперимента подтверждают развитие у животных с ВМК когнитивного дефицита - в восстановительном периоде после обучения в тесте условному рефлексу пассивного избегания (табл. 3) латентное время захода в тёмный отсек уменьшилось на 40% (pЛО <0,01). У животных, получавших ИЛ-2 (ронколейкин), отмечено увеличение латентного времени рефлекса по сравнению с группой КП, что свидетельствует о стабилизации процессов запоминания и уменьшении выраженности когнитивных нарушений (pКП <0,05). ВЫВОДЫ 1. Развитие экспериментального геморрагического инсульта у крыс сопровождалось типичными патофизиологическими признаками - окислительной модификацией белка с последующими неврологическими и когнитивными нарушениями, гибелью экспериментальных животных. 2. Применение интерлейкина-2 (ронколейкина) в дозе 0,01 мг/кг при лечебном режиме введения тормозит процессы свободнорадикального повреждения белков, что предупреждает гибель животных с внутримозговым кровоизлиянием, а также статистически значимо снижает выраженность постинсультных поведенческих, неврологических и когнитивных нарушений - улучшает показатели двигательной активности и психоневрологический статус по шкале McGrow, стабилизирует процессы запоминания. Следовательно, интерлейкин-2 (ронколейкин) эффективно предупреждает развитие постинсультных нейрональных нарушений, что в перспективе позволит применять его в качестве эффективного патогенетического церебропротектора. Рис. 1. Выживаемость крыс с экспериментальным геморрагическим инсультом. ЛО - группа ложнооперированных животных; ВМК - внутримозговое кровоизлияние; ИЛ - интерлейкин. Статистическая значимость различий (р <0,05): *относительно ЛО; Котносительно контроля. missing image file Таблица 1 Влияние интерлейкина-2 (ронколейкина) на содержание альдегидфенилгидразонов (АФГ) и карбоксилфенилгидразонов (КФГ) в ткани мозга крыс с геморрагическим инсультом (М±m) Группа животных АФГ, у.е./мг белка/мин КФГ, у.е./мг белка/мин 4-е сутки Ложнооперированные животные (n=10) 0,64±0,27 0,53±0,2 Контроль - животные с ВМК (n=5) 4,77±0,56* 3,31±0,39* Животные с ВМК + ИЛ-2 (ронколейкин) (n=6) 4,59±0,78* 3,59±0,44К 18-е сутки Ложнооперированные животные (n=10) 0,64±0,27 0,53±0,2 Контроль - животные с ВМК (n=3) 4,16±0,63* 3,18±0,46* Животные с ВМК + ИЛ-2 (ронколейкин) (n=6) 1,81±0,79* 0,99±0,2К Примечание. Статистически значимые различия (р <0,05): *относительно ложнооперированных животных, Котносительно животных контрольной группы. ВМК - внутримозговое кровоизлияние; ИЛ - интерлейкин. Рис. 2. Суммарный неврологический дефицит крыс с экспериментальным геморрагическим инсультом (шкала McGrow). КП 4 и КП 18 - группа контрольной патологии на 4-е и 18-е сутки эксперимента; Р 4 и Р 18 - группа интерлейкина-2 (ронколейкина) на 4-е и 18-е сутки. КРазличия статистически значимы (р <0,05) относительно группы КП. Таблица 2 Влияние ИЛ-2 (ронколейкина) на поведенческие реакции крыс с экспериментальным геморрагическим инсультом в тесте «открытое поле» (1 раз за время наблюдения - 3 мин, М±m) Группа животных Горизонтальные перемещения Вертикальные движения Исследование отверстий 4-е сутки 18-е сутки 4-е сутки 18-е сутки 4-е сутки 18-е сутки Ложнооперированные животные (n=10) 21,0±2,6 21,0±2,6 7,8±1,1 7,8±1,1 4,9±1,1 4,9±1,1 Контроль - животные с ВМК (n=5) 4,2±1,3* 8,8±1,5* 0,6±0,1* 1,2±0,1* 0,4±0,1* 2,6±0,2* Животные с ВМК + ИЛ-2 (ронколейкин) (n=6) 4,5±1,0* 18,0±1,7К 1,5±0,1* 2,1±0,2*К 1,6±0,1* 3,1±1,1*К Примечание. Статистически значимые различия (р <0,05): *относительно ложнооперированных животных, Котносительно животных контрольной группы. ВМК - внутримозговое кровоизлияние; ИЛ - интерлейкин. Таблица 3 Влияние ИЛ-2 (ронколейкина) на воспроизведение условного рефлекса пассивного избегания у крыс с экспериментальным геморрагическим инсультом (18-е сутки, М±m) Группа животных Латентный период захода в тёмную камеру до обучения, с Латентный период захода в тёмную камеру после обучения, с Ложнооперированные животные (n=10) 6,2±0,5 177,3±7,4 Контроль - животные с ВМК (n=5) 71,0±5,1* 116,8±5,3* Животные с ВМК + ИЛ-2 (ронколейкин) (n=6) 80,5±5,1* 164,8±6,4К Примечание. Статистически значимые различия (р <0,05): *относительно ложнооперированных животных, Котносительно животных контрольной группы. ВМК - внутримозговое кровоизлияние; ИЛ - интерлейкин.

About the authors

E V Suprun

National University of Pharmacy, Kharkiv, Ukraine

Email: suprun_elina@mail.ru

N A But

Dnepropetrovsk municipal clinical hospital № 4, Dnepropetrovsk, Ukraine

S V Tereshchenko

Dnepropetrovsk municipal clinical hospital № 4, Dnepropetrovsk, Ukraine

References

  1. Арушанян Э.Б., Бейер Э.В. Гиппокамп и нарушения познавательной деятельности // Ж. неврол. и психиатр. им. С.С. Корсакова. - 2007. - №7. - С. 72-77.
  2. Беридзе М.З., Урушадзе И.Т., Шакаришвили Р.Р. Механизмы отсроченной гибели нейронов при острой церебральной ишемии в эксперименте // Ж. неврол. и психиатр. им. С.С. Корсакова. Инсульт (приложение). - 2001. - №3. - С. 35-40.
  3. Виленский Б.С. Инсульт: профилактика, диагностика и лечение. - СПб: Фолиант, 2002. - 397 с.
  4. Губский Ю.И., Беленичев И.Ф., Павлов С.В. и др. Токсикологические последствия окислительной модификации белков при различных патологических состояниях (обзор литературы) // Совр. пробл. токсикол. - 2005. - №3. - С. 20-26.
  5. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. - М.: Медицина, 2001. - 328 с.
  6. Завалишин И.А., Захарова М.Н. Гибель нейрона - кардинальная проблема неврологии и психиатрии // Вестн. РАМН. - 2000. - №2. - С. 28-33.
  7. Козлов В.К. Сепсис: этиология, иммунопатогенез, концепция современной иммунотерапии. - Киев: АННА-Т, 2007. - 296 с.
  8. Лурия А.Р. Высшие корковые функции человека и их нарушения при локальных поражениях мозга. - М.: Медицина, 2000. - 287 с.
  9. Сазонтова Т.Г., Жукова А.Г., Анчишкина Н.А., Архипенко Ю.В. Фактор транскрипции HIF-1α, белки срочного ответа и резистентность мембранных структур в динамике после острой гипоксии // Вестн. РАМН. - 2007. - №2. - С. 17-25.
  10. Симбирцев А.С. Цитокины: классификация и биологические функции // Цитокины и воспаление. - 2004. - Т. 3, №2. - С. 16-22.
  11. Скворцова В.И. Механизмы повреждающего действия церебральной ишемии и новые терапевтические стратегии // Инсульт. - 2003. - №9. - С. 20-22.
  12. Arend W.P. The balance between IL-1 and IL-1Ra in disease // Cytokine Growth Factor Rev. - 2002. - Vol. 13 (4-5). - P. 323-340.
  13. Kehrer J.P. Cause-effect of oxidative stress and apoptosis // Teratology. - 2000. - Vol. 62. - P. 235-246.
  14. Kim H. M., Shin H.Y., Jeong H.J. et al. Reduced IL-2 but elevated IL-4, IL-6, and IgE serum levels in patients with cerebral infarction during the acute stage // J. Mol. Neurosci. - 2000. - Vol. 14 (3). - P. 191-196.
  15. Pulsinelli W.A. Selective neuronal vulnerability: morphological and molecular characterestics // Progr. Brain Res. - 1985. - Vol. 53. - Р. 29-37.

Statistics

Views

Abstract - 279

PDF (Russian) - 107

Cited-By


PlumX

Dimensions


© 2014 Suprun E.V., But N.A., Tereshchenko S.V.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.





This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies