Clinical course of neurological disorders in experimental hemorrhagic stroke after treatment with interleukin-2 (ronkoleukinum)

Full Text

Геморрагический инсульт (ГИ) - наиболее тяжёлая форма острого нарушения мозгового кровообращения. В последние десятилетия отмечен рост показателей его распространённости, в том числе среди лиц трудоспособного возраста, и тяжести. После ГИ выраженность нейродегенеративных изменений в пострадавшей области мозга уменьшается от центра к периферическим зонам пенумбры. Формирование окончательных размеров инфаркта мозга и последующих нейрональных потерь происходит в течение 3-5 сут с момента заболевания [11]. Следовательно, актуальным остаётся поиск новых средств фармакологической защиты мозга для эффективной коррекции неврологических нарушений [3, 5]. Первично при ГИ происходит поражение отдельных сверхчувствительных к ишемии нейронов, в дальнейшем вокруг геморрагического очага развивается вторичное повреждение как результат реакций локального воспаления, инициированных микроглией [13]. При этом отмечают значительное повышение уровней провоспалительных факторов, в том числе цитокинов - интерлейкинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8) и фактора некроза опухоли альфа (ФНОα) [12, 14]. Первым в зоне ишемии продуцируется ИЛ-1, который также стимулирует синтез секретируемых Т-хелперами ростовых факторов - ИЛ-2 и ИЛ-4 [9, 13]. ИЛ-2 участвует в формировании быстрого иммунного ответа - индуцирует пролиферацию В-лимфоцитов, активирует цитотоксические Т-лимфоциты [10, 14]. В клинической практике рекомбинантный ИЛ-2 (ронколейкин) используют для коррекции вторичной иммунной недостаточности - в комплексной терапии гнойно-воспалительных заболеваний и онкологических процессов [7]. Учитывая, что формирование нейродегенеративных изменений в зоне ГИ связано с «цитокиновым каскадом», в настоящей работе поставлена цель изучить взаимосвязь между эффектами рекомбинантного ИЛ-2 (ронколейкина), окислительным повреждением белков и выраженностью неврологических нарушений у крыс с экспериментальным ГИ. Исследования проводили на белых нелинейных крысах с массой тела 170-200 г. Внутримозговое кровоизлияние (ВМК) вызывали введением аутокрови во внутреннюю капсулу головного мозга под этаминал-натриевым наркозом (40 мг/кг). Животные были разделены на три группы по 20 крыс: первая группа - ложнооперированные животные (ЛО), которым в соответствии с методикой воспроизведения ВМК производили забор аутокрови из хвостовой вены без её введения во внутреннюю капсулу, вторая - животные с ВМК (контрольная патология - группа КП), третья - животные с патологией, которым ИЛ-2 (ронколейкин) в дозе 0,01 мг/кг (группа Р) вводили внутримышечно сразу после выхода животных из наркоза и в дальнейшем 1 раз в сутки в течение 18 дней. По истечении острого периода ишемии (4 дня) и фазы восстановления (18 дней) в гомогенате мозга биохимическими методами определяли содержание ранних [по уровню альдегидфенилгидразонов (АФГ)] и поздних [по уровню карбоксилфенилгидразонов (КФГ)] маркёров окислительной модификации белка. Для этого на 4-е и 18-е сутки исследования часть животных (половину голов в каждой группе) выводили из эксперимента путём декапитации под эфирным наркозом с целью получения биологического материала для проведения биохимических исследований. Также оценивали выживаемость крыс и динамику постишемических нарушений - на 4-е и 18-е сутки регистрировали неврологический дефицит по шкале Stroke-index McGrow (тяжесть состояния определяли по сумме соответствующих баллов) и ориентировочно-исследовательское поведение крыс (в условиях методики открытого поля - в течение 3 мин регистрировали горизонтальные и вертикальные перемещения, обследование отверстий). Обучение условному рефлексу пассивного избегания проводили по стандартной методике в восстановительном периоде ВМК (18-е сутки). Полученные результаты проанализированы с использованием t-критерия Стьюдента, U-параметра Манна-Уитни и критерия χ2. Статистически значимыми считали различия с уровнем значимости более 95% (р <0,05), которые отмечали как рЛО (относительно ложнооперированных животных) или рКП (относительно контроля). В ходе эксперимента в течение 7 сут после ВМК в группе ЛО гибели животных не наблюдали. В контрольной группе случаи гибели крыс происходили до 4-х суток включительно (рис. 1), показатель летальности увеличился с 50% в 1-3-и сутки до 70% на 4-7-е сутки. Гибель животных, получавших ИЛ-2 (ронколейкин), наблюдалась только в 1-е сутки, показатель выживаемости значимо отличался от группы КП, начиная с 4-х суток эксперимента (рКП <0,05). Снижение поступления молекулярного кислорода в нейроны стимулирует образование активных форм кислорода, которые обладают высокой реакционной способностью и потенциально опасны для клеточных структур. Окислительный стресс развивается в условиях резкой активации окислительных процессов при недостаточной эффективности антиоксидантной защиты. Образовавшиеся при церебральной ишемии повышенные уровни активных форм кислорода инициируют прямую деструкцию нуклеиновых кислот и вызывают окислительную модификацию белка [4], стимулируют синтез провоспалительных цитокинов и формируют порочный круг вторичных повреждений [9, 15]. ВМК у экспериментальных животных на протяжении всего эксперимента сопровождалось повышенным содержанием показателей окислительной модификации белка - уровень раннего (АФГ) и позднего (КФГ) маркёров был повышен соответственно в 5,3 и 4,5 раза на 4-е сутки и в 5,5 и 5 раз на 18-е сутки наблюдения (рЛО <0,01, табл. 1). Применение ИЛ-2 (ронколейкина) привело к торможению процессов свободнорадикального повреждения белков - показатели окислительной модификации белка к 18-м суткам были на 56-70% ниже уровней контроля (рКП <0,01). При ВМК происходят последовательные процессы микроциркуляторно-клеточного каскада - снижение мозгового кровотока приводит к максимуму энергетического дефицита, развивается глутаматная эксайтотоксичность, происходит массивное внутриклеточное поступление ионов натрия и кальция, что стимулирует активацию фосфолипаз и протеиназ с образованием цитокинов и оказывает негативное воздействие на межклеточные структуры, окружающие клеточные мембраны и сосудистую стенку. Это способствует формированию цитотоксического отёка глии и нейронов, проникновению токсических веществ из сосудистого русла в мозговую ткань на фоне продолжающихся оксидантных и прокоагуляционных реакций и гибели жизненно важных нейронов с формированием неврологического дефицита [6]. Исследование неврологического статуса крыс по отдельным показателям шкалы McGrow показало, что у крыс группы ЛО тяжёлые неврологические нарушения в виде манежных движений, парезов и параличей не наблюдались. У большинства животных группы КП в остром и восстановительном периодах после ВМК неврологические нарушения были умеренно выраженными (вялость, замедленность движений, слабость конечностей, птоз) и тяжёлыми (манежные движения, парезы и параличи конечностей). Стабилизация ИЛ-2 (ронколейкином) неврологического статуса крыс после ВМК подтверждается существенным снижением частоты парезов и параличей конечностей, манежных движений (эффекты более выражены в периоде восстановления), а также снижением суммы баллов по шкале McGrow (рис. 2), которая в восстановительном периоде была значительно ниже и значимо отличалась от группы КП (pКП <0,01). В эксперименте ВМК привело к выраженному снижению ориентировочно-исследовательской и двигательной активности животных - у крыс группы КП (табл. 2) количество стоек, пересечённых квадратов и исследованных отверстий уменьшилось на 4-е сутки эксперимента на 80-94% по сравнению с группой ЛО (pЛО <0,001) с незначительной динамикой этих показателей к 18-м суткам эксперимента (pЛО <0,01). Активное восстановление показателей ориентировочно-исследовательского поведения происходило в группе животных, получавших ИЛ-2 (ронколейкин), - к 18-м суткам количество горизонтальных и вертикальных движений относительно КП увеличились соответственно на 48 и 61% (pКП <0,01), ориентировочно-исследовательская активность - на 33% (pКП <0,05), что также свидетельствует о стабилизации неврологического статуса. По сравнению с прочими элементами мозга, страдающими от ишемического воздействия, особую ранимость обнаруживают нейроны гиппокампа [15], которые участвуют в реализации процессов приобретения и консолидации следов памяти и организации ориентировочного рефлекса [8]. Фокальная или глобальная ишемия неизменно сопровождается поражениями гиппокампа и ведёт к когнитивной патологии [1, 2]. Данные проведённого эксперимента подтверждают развитие у животных с ВМК когнитивного дефицита - в восстановительном периоде после обучения в тесте условному рефлексу пассивного избегания (табл. 3) латентное время захода в тёмный отсек уменьшилось на 40% (pЛО <0,01). У животных, получавших ИЛ-2 (ронколейкин), отмечено увеличение латентного времени рефлекса по сравнению с группой КП, что свидетельствует о стабилизации процессов запоминания и уменьшении выраженности когнитивных нарушений (pКП <0,05). ВЫВОДЫ 1. Развитие экспериментального геморрагического инсульта у крыс сопровождалось типичными патофизиологическими признаками - окислительной модификацией белка с последующими неврологическими и когнитивными нарушениями, гибелью экспериментальных животных. 2. Применение интерлейкина-2 (ронколейкина) в дозе 0,01 мг/кг при лечебном режиме введения тормозит процессы свободнорадикального повреждения белков, что предупреждает гибель животных с внутримозговым кровоизлиянием, а также статистически значимо снижает выраженность постинсультных поведенческих, неврологических и когнитивных нарушений - улучшает показатели двигательной активности и психоневрологический статус по шкале McGrow, стабилизирует процессы запоминания. Следовательно, интерлейкин-2 (ронколейкин) эффективно предупреждает развитие постинсультных нейрональных нарушений, что в перспективе позволит применять его в качестве эффективного патогенетического церебропротектора. Рис. 1. Выживаемость крыс с экспериментальным геморрагическим инсультом. ЛО - группа ложнооперированных животных; ВМК - внутримозговое кровоизлияние; ИЛ - интерлейкин. Статистическая значимость различий (р <0,05): *относительно ЛО; Котносительно контроля. missing image file Таблица 1 Влияние интерлейкина-2 (ронколейкина) на содержание альдегидфенилгидразонов (АФГ) и карбоксилфенилгидразонов (КФГ) в ткани мозга крыс с геморрагическим инсультом (М±m) Группа животных АФГ, у.е./мг белка/мин КФГ, у.е./мг белка/мин 4-е сутки Ложнооперированные животные (n=10) 0,64±0,27 0,53±0,2 Контроль - животные с ВМК (n=5) 4,77±0,56* 3,31±0,39* Животные с ВМК + ИЛ-2 (ронколейкин) (n=6) 4,59±0,78* 3,59±0,44К 18-е сутки Ложнооперированные животные (n=10) 0,64±0,27 0,53±0,2 Контроль - животные с ВМК (n=3) 4,16±0,63* 3,18±0,46* Животные с ВМК + ИЛ-2 (ронколейкин) (n=6) 1,81±0,79* 0,99±0,2К Примечание. Статистически значимые различия (р <0,05): *относительно ложнооперированных животных, Котносительно животных контрольной группы. ВМК - внутримозговое кровоизлияние; ИЛ - интерлейкин. Рис. 2. Суммарный неврологический дефицит крыс с экспериментальным геморрагическим инсультом (шкала McGrow). КП 4 и КП 18 - группа контрольной патологии на 4-е и 18-е сутки эксперимента; Р 4 и Р 18 - группа интерлейкина-2 (ронколейкина) на 4-е и 18-е сутки. КРазличия статистически значимы (р <0,05) относительно группы КП. Таблица 2 Влияние ИЛ-2 (ронколейкина) на поведенческие реакции крыс с экспериментальным геморрагическим инсультом в тесте «открытое поле» (1 раз за время наблюдения - 3 мин, М±m) Группа животных Горизонтальные перемещения Вертикальные движения Исследование отверстий 4-е сутки 18-е сутки 4-е сутки 18-е сутки 4-е сутки 18-е сутки Ложнооперированные животные (n=10) 21,0±2,6 21,0±2,6 7,8±1,1 7,8±1,1 4,9±1,1 4,9±1,1 Контроль - животные с ВМК (n=5) 4,2±1,3* 8,8±1,5* 0,6±0,1* 1,2±0,1* 0,4±0,1* 2,6±0,2* Животные с ВМК + ИЛ-2 (ронколейкин) (n=6) 4,5±1,0* 18,0±1,7К 1,5±0,1* 2,1±0,2*К 1,6±0,1* 3,1±1,1*К Примечание. Статистически значимые различия (р <0,05): *относительно ложнооперированных животных, Котносительно животных контрольной группы. ВМК - внутримозговое кровоизлияние; ИЛ - интерлейкин. Таблица 3 Влияние ИЛ-2 (ронколейкина) на воспроизведение условного рефлекса пассивного избегания у крыс с экспериментальным геморрагическим инсультом (18-е сутки, М±m) Группа животных Латентный период захода в тёмную камеру до обучения, с Латентный период захода в тёмную камеру после обучения, с Ложнооперированные животные (n=10) 6,2±0,5 177,3±7,4 Контроль - животные с ВМК (n=5) 71,0±5,1* 116,8±5,3* Животные с ВМК + ИЛ-2 (ронколейкин) (n=6) 80,5±5,1* 164,8±6,4К Примечание. Статистически значимые различия (р <0,05): *относительно ложнооперированных животных, Котносительно животных контрольной группы. ВМК - внутримозговое кровоизлияние; ИЛ - интерлейкин.

About the authors

E V Suprun

National University of Pharmacy, Kharkiv, Ukraine

Email: suprun_elina@mail.ru

N A But

Dnepropetrovsk municipal clinical hospital № 4, Dnepropetrovsk, Ukraine

S V Tereshchenko

Dnepropetrovsk municipal clinical hospital № 4, Dnepropetrovsk, Ukraine

References

Supplementary files