Local and systemic antioxidant status in experimental purulent corneal ulcer

Full Text

Воспалительные поражения глаз инфекционной и, реже, неинфекционной природы относятся к числу наиболее распространённых заболеваний человека. Несмотря на применение современных лекарственных препаратов, эффективность лечения этих заболеваний не достигает 100%. Частота осложнений бактериальных язв роговицы в виде развития десцеметоцеле, перфораций, абсцессов роговицы, эндофтальмита и панофтальмита варьирует от 9 до 37,9% [4]. Данные обстоятельства приводят к необходимости разработки оптимизированных подходов к фармакотерапии данной патологии, что невозможно сделать без детального изучения патогенеза. Цель исследования - изучить системный и локальный свободнорадикальный статус при экспериментальной гнойной язве роговицы. Исследование выполнено на кроликах-самцах породы шиншилла со средней массой тела 3500±200 г. 10 интактных кроликов (10 глаз) служили контролем. На 40 животных (40 глаз) моделировали стафилококковую гнойную язву роговицы по методике Н.А. Адамовой (1999). После инстилляционной анестезии 0,5% раствором проксиметакаина в центральных отделах роговицы трепаном диаметром 5 мм наносили насечку на глубину 150 мкм, в пределах которой роговицу расслаивали, отсепарованные слои удаляли. В полученный дефект втирали одну стандартную петлю (107-108 КОЕ) чистой культуры золотистого стафилококка. Через сутки после нанесения микроорганизмов на всех глазах развивались типичные гнойные язвы роговицы. Патологию воспроизводили на одном глазу животных. Кроликов со сформировавшейся моделью язвы выводили из эксперимента на 3-и, 7-е, 14-е и 21-е сутки после внесения культуры, на каждый срок по 10 кроликов (10 глаз). Животных забивали методом воздушной эмболии. В гомогенате роговицы и лизате эритроцитов определяли: - концентрацию малонового диальдегида (МДА) по реакции с тиобарбитуровой кислотой (метод И.Д. Стальной, Т.Г. Горишвили, 1977); - уровень безбелковых тиоловых групп (SH) по реакции восстановления дисульфид 5,5-дитиобис(2-нитробензоата) (метод Habeeb, 1972); - активность супероксиддисмутазы (СОД) по реакции торможения аутоокисления кверцитина (метод В.А. Костюк и соавт., 1990; С.О. Бурмистрова и соавт., 1997); - активность глутатионпероксидазы (ГПО) по реакции ферментативного восстановления глутатиона гидроперекисью третбутила (метод D.E. Paglia, W.N. Valentine, 1967, в модификации В.З. Ланкина, 1976); - активность глутатион-S-трансферазы (ГТ) по реакции ферментативной конъюгации глутатиона с 1-хлор-2,4-динитробензолом (метод J.N. Keen, W.B. Iakoby, 1978). Статистическую обработку полученных результатов выполняли с помощью пакета прикладных программ «Statistica 6.1». Характер распределения данных определяли по критерию Шапиро-Уилка. Различия между сериями, имеющими нормальное распределение, оценивали методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), использовали тест Ньюмена-Кейсла. Для оценки зависимости концентрации МДА в гемолизате эритроцитов (характеризует выраженность системного окислительного стресса) от показателей оксидантной-антиоксидантной системы роговицы и эритроцитов использовали коэффициент корреляции Пирсона (r). У всех животных гнойная язва сформировалась в течение 12-24 ч после внесения культуры. С 1-х по 3-и сутки опыта клиническая картина гнойной язвы соответствовала стадии инфильтрации. Отмечали умеренный отёк век, гнойный инфильтрат в центре роговицы с дефектом эпителия размером в среднем 5±1 мм, утолщение стромы, перифокальный отёк. С 3-х по 7-е сутки эксперимента развивался отёк век, гнойное отделяемое сохранялось, в ряде случаев даже увеличивалось. В 87,5% случаев сформировался язвенный дефект, разный по площади и глубине. В 12,5% случаев инфильтрат не перешёл в стадию изъязвления, появлялись признаки начала эпителизации. С 7-х по 21-е сутки экспериментальной гнойной язвы инфильтрация роговицы уменьшалась как по площади, так и по интенсивности, отмечались смешанная васкуляризация роговицы, задние синехии и деформация зрачка в одну треть глаза. В 11,1% случаев начался процесс формирования рубцового помутнения роговицы. В стадии изъязвления на 9 глазах сформировалось десцеметоцеле, закончившееся в 5 случаях перфорацией глаза. Развитие экспериментальной гнойной язвы роговицы сопровождалось активацией процессов перекисного окисления липидов (табл. 1). Концентрация МДА - конечного продукта пероксидации - в роговице повышалась с 3-го дня патологии на 51,6% (р <0,05) по сравнению с показателями интактных животных, достигала своего максимума на 7-е сутки эксперимента, превышая исходные значения на 58,1% (р <0,05), и нормализовалась к 21-му дню патологии (p >0,05). Уровень SH снижался на 16,3% (р <0,05), начиная с 3-го дня патологии, достигал минимального значения (на 50,0% ниже исходной концентрации, р <0,05) на 7-е сутки эксперимента и нормализовался только к 21-му дню развития гнойной язвы (р >0,05). Активность ГПО увеличивалась на 3-и сутки патологии на 13,9% (р <0,05) по сравнению с показателями интактных животных и нормализовалась к 7-м суткам эксперимента. Активность ГТ снижалась на 7-е сутки гнойной язвы на 20,8% (p <0,05) и увеличивалась на 21-е сутки эксперимента на 20,8% (р <0,05). Активность СОД снижалась с 3-х по 14-е сутки гнойной язвы с максимумом на 7-е сутки (на 41,9%, р <0,05). Аналогичные результаты получены и при изучении свободнорадикального статуса в гемолизате эритроцитов (см. табл. 1). Концентрация МДА повышалась на 3-и и 7-е сутки патологии (на 36,2 и 40,9% соответственно по сравнению с показателями интактных животных, р <0,05) и нормализовалась к 14-м суткам. Уровень SH снижался с 3-х суток патологии, достигал минимального значения на 7-е сутки (на 34,9%, р <0,05) и нормализовался к 14-му дню. Активность ГТ снижалась по сравнению с показателями интактных животных лишь на 7-е сутки эксперимента на 30,0% (р <0,05). Активность ГПО уменьшалась на 7-е сутки патологии на 29,5% (р <0,05), а на 14-е сутки - на 21,9% (р <0,05). Активность СОД снижалась на 3-и и 7-е сутки патологии на 21,1% (p <0,05). При изучении зависимости выраженности системного окислительного стресса от свободнорадикального статуса роговицы и эритроцитов была выявлена прямо пропорциональная связь между концентрацией МДА в лизате эритроцитов и концентрацией МДА в роговице (r=0,57, p=0,00) и обратно пропорциональная связь между концентрацией МДА в лизате эритроцитов и концентрацией SH в роговице (r=-0,3, p=0,03), в гемолизате (r=-0,39, p=0,00), активностью ГТ в роговице (r=-0,48, p=0,00), активностью СОД в роговице (r=-0,34, p=0,013) и гемолизате (r=-0,7, p=0,00, рис. 1). В настоящем исследовании установлено, что стафилококковая гнойная язва роговицы на стадии инфильтрации и изъязвления (3-7-е сутки) сопровождается активацией процессов перекисного окисления липидов в роговице, что соответствует максимальной выраженности воспалительного процесса. Согласно данным литературы, это происходит за счёт чрезмерного образования свободных радикалов эндогенными и экзогенными источниками. К эндогенным источникам относятся макрофаги крови, инфильтрирующие ткань роговицы при воспалении, а также моноциты, нейтрофилы, эозинофилы, эндотелиальные, гладкомышечные и другие клетки [2]. В них в ходе функционирования НАДФН2-оксидазного комплекса и миелопероксидазы происходит усиленное образование активных форм кислорода, нацеленных на обезвреживание чужеродных микроорганизмов [1]. Из экзогенных источников свободных радикалов, как и в здоровой роговице, основную роль играет ультрафиолетовое излучение солнечного света [3]. В ответ на повышенное образование свободных радикалов на 2-3-и сутки происходит разбалансировка антиоксидантной системы: концентрация свободных SH-групп, активность СОД и ГТ снижаются, тогда как активность ГПО кратковременно повышается. Это повышение активности фермента, участвующего в метаболизме глутатиона, можно расценить как компенсаторно-приспособительную реакцию, однако на 5-7-е сутки происходит дальнейшее развитие местного окислительного стресса: интенсификация окислительных процессов на фоне снижения активности всех изучаемых антиоксидантных ферментов, что коррелирует с ухудшением клинической картины - усилением инфильтрации и изъязвлением роговицы. В лизате эритроцитов в данные сроки эксперимента также отмечена активация свободнорадикального окисления, которая проявлялась повышением уровня МДА, снижением концентрации SH-групп и активности антиоксидантных ферментов с максимумом выраженности на 3-7-е сутки. Компенсаторного увеличения активности антиоксидантных ферментов выявлено не было, что, скорее всего, связано с отсутствием синтетической активности в эритроцитах. Нормализация свободнорадикального статуса роговицы и эритроцитов происходила к 21-му дню патологии, что соответствует развитию соединительнотканного рубца в роговице. При изучении зависимости концентрации МДА в лизате эритроцитов от показателей оксидантной-антиоксидантной системы роговицы и эритроцитов наиболее сильная прямо пропорциональная связь была получена с концентрацией МДА в роговице, а максимальная обратно пропорциональная связь выявлена с активностью СОД в эритроцитах, что свидетельствует о том, что системный редокс-статус зависит, с одной стороны, от выраженности локального воспалительного процесса, а с другой - от состояния антиоксидантной системы в эритроцитах, в частности от активности СОД. ВЫВОДЫ 1. Развитие экспериментальной стафилококковой язвы роговицы сопровождается местным и системным окислительным стрессом, что проявляется повышением уровня малонового диальдегида, снижением содержания безбелковых сульфгидрильных групп и уменьшением активности антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы, глутатион-S-трансферазы. 2. Существует прямо пропорциональная связь между концентрацией малонового диальдегида в лизате эритроцитов и концентрацией малонового диальдегида в роговице, а также обратно пропорциональная связь между концентрацией малонового диальдегида в лизате эритроцитов и концентрацией свободных SH-групп в роговице и гемолизате, активностью глутатион-S-трансферазы в роговице, активностью супероксиддисмутазы в роговице и гемолизате. 3. Различный профиль изменения локального и системного свободнорадикального статуса на разных стадиях патологического процесса, зафиксированное достоверное нарастание дисбаланса оксидация/антиоксидантная защита в фазах инфильтрации и изъязвления дают основу для разработки патогенетически ориентированного применения антиоксидантов при гнойной язве роговицы. Работа поддержана грантом президента РФ №МК-4993.2012.7. Таблица 1 Выраженность окислительного стресса в роговице и гемолизате при развитии стафилококковой гнойной язвы роговицы (M±m) Серии эксперимента МДА, нмоль/мг белка Свободные SH-группы, мкмоль/мг белка Активность СОД, единицы активности на 1 мг белка Активность ГПО, нмоль НАДФН/мин на 1 мг белка Активность ГТ, мкмоль ХДНБ/мин на 1 мг белка Роговица Интактные кролики 3,1±0,19 20,2±0,79 3,1±0,08 19,3±0,54 2,4±0,14 Язва на 3-и сутки 4,7±0,28* 16,9±1,47* 2,8±0,09* 22,0±0,80* 2,1±0,12 Язва на 7-е сутки 4,9±0,24* 10,1±0,54* 1,8±0,18* 17,7±0,66 1,9±0,09* Язва на 14-е сутки 4,1±0,22* 15,7±0,67* 2,4±0,13* 17,9±0,49 2,4±0,08 Язва на 21-е сутки 3,3±0,24 18,2±0,77 3,1±0,08 19,2±0,58 2,9±0,06* Гемолизат Интактные кролики 10,5±0,72 48,7±2,00 1,9±0,08 10,5±0,64 1,0±0,05 Язва на 3-и сутки 14,3±0,78* 36,9±2,10* 1,5±0,08* 9,9±0,51 1,1±0,07 Язва на 7-е сутки 14,8±0,63* 31,7±1,82* 1,5±0,07* 7,4±0,52* 0,7±0,08* Язва на 14-е сутки 10,8±0,94 35,5±1,39* 1,8±0,07 8,2±0,29* 0,9±0,07 Язва на 21-е сутки 9,0±0,61 45,8±2,50 1,9±0,07 10,3±0,53 0,9±0,04 Примечание: МДА - малоновый диальдегид; SH - безбелковые тиоловые группы; СОД - супероксиддисмутаза; ГПО - глутатионпероксидаза; НАДФН - восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат; ГТ - глутатион-S-трансфераза; ХДНБ - 1-хлоро-2,4-динитробензол; *р <0,05 - статистически значимые различия по сравнению с показателями интактных животных. Рис. 1. Зависимость концентрации малонового диальдегида (MDA) в гемолизате эритроцитов от показателей оксидантной-антиоксидантной систем роговицы и эритроцитов; SH-группы - тиоловые группы; GT - глутатион-S-трансфераза; SOD - супероксиддисмутаза. Колесников - рис. 1.tif

About the authors

A V Kolesnikov

Ryazan State Medical University, Ryazan, Russia

A V Shchulkin

Ryazan State Medical University, Ryazan, Russia

O I Barenina

Ryazan State Medical University, Ryazan, Russia

Email: kolyuchk@mail.ru

V I Konopleva

Ryazan State Medical University, Ryazan, Russia

References

Supplementary files