Pilot cross-sectional study for potential fibrogenic risk assessment in real multiwalled carbon nanotube aerosol exposure at the workplaces

Cover Page

Abstract

Aim. To assess the potential fibrogenic risk of real occupational exposure to multi-walled carbon nanotubes (MWCNT). Methods. The study was conducted at 2 MWCNT-producing enterprises with the same reactor type. 11 employees who had more than 1 year-long contact with MWCNT aerosol were included in the exposure group, the control group consisted of 14 people. Elemental carbon level and MWCNT presence were evaluated in workplace air samples by transmission electron microscopy. Blood and induced sputum samples were obtained from employees, transforming growth factor beta 1 (TGFβ 1), KL-6 glycoprotein and osteopontin levels were evaluated. To assess the relationship between MWCNT exposure and biomarker levels (age, gender, smoking were chosen as cofounders), generalized linear models including main effects and paired interactions were created. The regression coefficients confidence intervals were refined by bootstrap analysis. Results. Time-weighted average respirable MWCNT fraction was up to 6.11 mg/m 3. Transmission electron microscopy showed the presence of MWCNT agglomerates sized 0.5-10 μm in all air samples. The levels of TGFβ 1 in serum were significantly dependent on exposure to MWCNTs (b=10.47, 95% BCa=1.18-51.75), the KL-6 glycoprotein levels in induced sputum was significantly higher in exposure group (b=235.9, 95% BCa=21.2-482) compared to control group. Osteopontin did not prove itself as an informative indicator. Conclusion. Gained data suggest that MWCNT aerosol exposure at workplace may lead to fibrogenic biomarkers level changes in serum and induced sputum samples. Control measures for MWCNT aerosol levels and medical surveillance for employees should be introduced in MWCNT-producing and applying facilities.

Full Text

Количество предприятий, на которых хоальвеолярном лаваже [5]. Целью пилотного синтезируют или применяют углеродные на-кросс-секционного исследования была оценка нотрубки (УНТ), растёт из года в год, так как потенциального фиброгенного риска у человепроизводство из лабораторий выходит на про-ка в условиях реальных экспозиций к аэрозолю мышленный уровень. Мировой рынок УНТ до-МУНТ на рабочих местах. стиг 192 млн долларов в 2011 г., есть основания Исследование проводилось на двух предпредполагать рост до 527 млн долларов в 2016 г. приятиях-производителях МУНТ, используюсо среднегодовым темпом 22,4% [3]. В России та-щих один и тот же тип реактора для синтеза. ких предприятий несколько (в Тамбове, Влади-Всего участвовали 25 работников обоих полов в мире, Новосибирске, Калининграде), и их ко-возрасте 18-65 лет, не имеющих хронического личество увеличивается в связи с ростом спроса заболевания органов дыхания, установленного на продукцию. Производства представлены в до начала работы с УНТ. В экспозиционную основном малыми предприятиями, созданны-группу (11 человек) включены работники, имевми на базе вузов и исследовательских учрежде-шие стаж работы в контакте с аэрозолем МУНТ ний. При этом несколько крупных производств на предприятии более 1 года; перечень професнаходится в проектной стадии. сий включал мастеров, специалистов, инже УНТ, состоящие из одного или нескольких неров-конструкторов, ремонтников, научных свёрнутых листов графена, имеют двойствен-сотрудников. Контрольная группа (14 человек) ную природу. Согласно определению Европей-включала людей, не подверженных экспозиции ского союза (2011) [2], они относятся к нанома-к аэрозолю МУНТ, работающих на тех же предтериалам, с другой стороны, морфология УНТ приятиях. позволяет отнести их к волокнам. В настоящее Критерием наличия контакта с аэрозолем время накоплен значительный объём сведений МУНТ на рабочих местах были данные оценки о заболеваниях органов дыхания, развивающих-содержания элементного углерода и обнаружеся от воздействия аэрозолей частиц волоконной ние отдельных нанотрубок и их агломератов природы [4, 14]. Кроме того, наноразмерные методом просвечивающей электронной микроматериалы имеют высокую проникающую спо-скопии в пробах воздуха рабочей зоны. собность и реактогенность [10]. Все это обуслов-Отбор проб воздуха осуществлялся в зоне ливает необходимость опережающих медико-дыхания в течение 90 мин со скоростью биологических исследований УНТ, включая 3 л/мин (270 л воздуха), в том числе с испольоценку потенциального риска для работников зованием циклона для отбора респирабельной и населения в целом. фракции аэрозоля. Проба воздуха отбиралась В исследованиях на мышах нами был обна-на высокочистый кварцевый фильтр, содержаружен профибротический потенциал нативных ние элементного углерода определяли с помопромышленных многослойных УНТ (МУНТ), щью термооптического анализатора (модифипричём гистологическая картина фиброза со-цированный метод NIOSH 5040 [11]). провождалась достоверным дозо-и времязависи-Просвечивающую электронную микроскомым повышением уровня таких биологических пию в сочетании с энергодисперсионной рентмаркёров, как трансформирующий фактор ро-геновской спектроскопией осуществляли после ста b и остеопонтин в сыворотке крови и брон-отбора проб воздуха на фильтры из смешанных эфиров целлюлозы модифицированным методом NMAM 7402 [11] на просвечивающем электронном микроскопе JEOL 2100F. Для проведения пилотного исследования были выбраны наименее инвазивные методы - отбор крови и индуцированной мокроты. Метод индуцированной мокроты заключается в получении образцов мокроты при отсутствии её спонтанного отделения (у здоровых и практически здоровых лиц) путём вдыхания обследуемым аэрозолированного гипертонического раствора, что вызывает увеличение бронхиальной секреции [12]. Данный метод позволяет получать образцы мокроты из глубоких отделов дыхательных путей, при этом являясь неинвазивным и минимально дискомфортным для обследуемых. После центрифугирования отобранных проб и отделения клеточного осадка в супернатанте определяли необходимые показатели. В сыворотке крови и образцах мокроты с применением коммерческих наборов для иммуноферментного анализа определяли содержание трансформирующего фактора роста β1 (TGFβ1), гликопротеина KL-6 (Krebsvonden Lungen-6) и остеопонтина. TGFb - белок, участвующий в пролиферации, клеточной дифференциации, апоптозе и множестве других процессов, а также играющий роль в развитии фиброза, опухолевых заболеваний, сахарного диабета, заболеваний сердечно-сосудистой системы [8]. Муциноподобный высокомолекулярный гликопротеин экспрессируется альвеолоцитами II порядка и клетками бронхиального эпителия человека. Было показано, что содержание KL-6 в сыворотке крови служит маркёром активности течения интерстициальной пневмонии, альвеолярного протеиноза, респираторного дистресс-синдрома и других интерстиционных заболеваний [7]. Остеопонтин экспрессируется в различных гранулёмах, в том числе при силикозе [9]. Кроме того, было показано, что уровень остеопонтина в сыворотке крови может коррелировать с выраженностью фибротических изменений в лёгких при асбестозе [13]. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом Казанского государственного медицинского университета (протокол №14 от 26.12.2011), от работников было получено информированное согласие. Для статистического анализа использовали статистическую среду R. Методами последовательного исключения и полного перебора создавались обобщённые линейные модели (GLM) второго уровня, включавшие как главные эффекты, так и попарные взаимодействия. Отбор моделей осуществлялся на основании оценки критерия информации Акайке (AIC), теста отношения правдоподобия и дисперсионного анализа. Доверительные интервалы регрессионных коэффициентов, полученные на основе малой выборки, уточнялись методом бутстрепанализа, который позволяет многократно извлекать повторные выборки из эмпирического распределения [1]. На основе разброса значений анализируемого показателя, полученного в процессе многократной имитации (1000 псевдовыборок), строились доверительные бутстреп-интервалы (ВСа), на основании которых делали заключение о статистической значимости взаимосвязей. В ходе гигиенической оценки рабочих мест были выявлены основные критические точки производственного процесса, на которых существовала возможность контакта работников с аэрозолированными МУНТ: выгрузка/сбор синтезированных МУНТ из реактора, механическая дезинтеграция на электромельнице, упаковка и фасовка готового продукта, работа с МУНТ в условиях лаборатории. Результаты оценки приведены в табл. 1. Просвечивающая электронная микроскопия показала наличие агломератов МУНТ с максимальными размерами от 0,5 до 10 мкм во всех в отобранных пробах (рис. 1). Агломераты Таблица 1 Оценка содержания элементного углерода (ЭУ) в воздухе рабочей зоны (К) на различных этапах технологического процесса Этап технологического процесса Циклон ЭУ, К разовая, мкг/м3 ЭУ, К среднесменная, мкг/м3 Сбор про + 32,59 6,11 дукта - 157,77 29,60 Дезинтегра + 10,83 2,03 ция продукта - 10,92 2,05 Упаковка + 14,15 2,65 продукта - 134,85 25,30 Работа в лабо + 2,87 0,54 ратории - 3,78 0,71 Таблица 2 Содержание исследуемых биомаркёров в сыворотке крови и мокроте работников Группы работников TGFb, сыворотка, пкг/мл TGFb, мокрота, пкг/мл KL-6, сыворотка, нг/мл KL-6, мокрота, нг/мл Остеопонтин, сыворотка, пкг/мл Экспозиционная группа (n=11) 19,88±1,57 5,00±0,95 293,16±29,46 176,38±107,63 68,98±7,2 Контрольная группа (n=14) 22,05±0,89 4,91±0,34 297,06±37,81 12,2±8,6907 59,19±5,37 Примечание: TGFb - трансформирующий фактор роста β. Рис. 1. Агломераты многослойных углеродных нанотрубок в воздухе рабочей зоны. Изображение, полученное при просвечивающей электронной микроскопии. Слева - участок сбора продукта из реактора. Справа - участок фасовки продукта. представляли собой либо переплетённые нанотрубки и матрикс (аморфный углерод и остатки катализатора), либо клубки нанотрубок. Отдельных нанотрубок обнаружено не было. Результаты определения содержания TGFb, KL-6 и остеопонтина в сыворотке крови и образцах мокроты исследуемых работников представлены в табл. 2. Регрессионные модели строились на основании следующих зависимых переменных: «наличие/отсутствие экспозиции» и кофаундеры - возраст, пол, курение. Наилучшие модели с указанием коэффициентов b, стандартных и бутстреп доверительных интервалов приведены в табл. 3. Гигиеническая оценка подтвердила наличие экспозиции лиц, занятых на производстве МУНТ, к аэрозолю этих наночастиц. Наиболее высокие значения содержания элементного углерода были обнаружены в ходе выгрузки синтезированного продукта из реактора. В силу отсутствия отечественных нормативов полученные среднесменные концентрации сравнивали с уровнем респирабельной фракции, рекомендованным Национальным институтом безопасности и здоровья труда, США (NIOSH) - 1 мкг/м3 [11]. В нашем случае среднесменные концентрации респирабельной фракции в зоне дыхания работника достигали 6,11 мкг/м3 . Это свидетельствует о возможном риске развития патологических состояний в ходе продолжительного контакта с аэрозолем МУНТ. Фактор «экспозиция к МУНТ» вошёл в модель, созданную для содержания TGFb1 в сыворотке крови, с положительным достоверным коэффициентом b=10,47 (95% BCa=1,18-51,75), что свидетельствует о прямой зависимости содержания TGFb1 в сыворотке от контакта с МУНТ. Сочетание «возраст + экспозиция» имело достоверный отрицательный регрессионный коэффициент b=-0,4 [95% BCa=-(2,02-0,08)], то есть в экспонированной группе показатель был выше у более молодых работников. Курение статистически значимо не влияло на содержание этого белка. В модели для TGFb1 в мокроте наблюдались те же тенденции, но доверитель Таблица 3 Описание наилучших регрессионных моделей и их регрессионных коэффициентов β (CI - доверительный интервал, BCa - бутстреп-интервал) Пока Свободный Возраст Экспозиция Возраст + экспозиция Курение затель, член среда уравне b CI BCa b CI BCa b CI BCa b CI BCa ния TGFb, сыворотка 15,41 0,24 (-0,87, 1,35) (-0,03, 0,58) 10,47* (6,07, 14,87) (1,18, 51,75) -0,4* (-0,54, -0,26) (-2,02, -0,08) - - - TGFb, мокрота 2,34 0,1 (0,02, 0,18) (-0,13, 0,19) 0,28 (-2,28, 2,84) (-5,87, 5,67) -0,04 (-0,13, 0,05) (-0,19, 0,24 ) - - - KL-6, сыворотка 221,96 2,67 (-1,47, 6,81) (-8,80, 31,57) -48,7 (-216,31, 118,99) (-354,48, 798,35) 0,52 (-4,52, 5,56) (-34,53, 11,31) - - - KL-6, мокрота 148,85 -5,24* (-7,64, -2,84) (-11,91, 0,58) 235,9** (169,4, 302,4) (21,2, 482) - - - - - - Остеопонтин, сыворотка 98,71 -1,46* (-2,08, -0,84) (-2,30, 1,68) -36,13 (-50,43, -11,87) (-90,78, 44,97) 1,84* (1,08, 2,6) (-1,52, 3,61) 19,2 (1,64, 36,76) (-15,81, 32,75) Примечание: *p <0,05; **p <0,01; TGFb - трансформирующий фактор роста b. ные интервалы регрессионных коэффициентов включали нулевое значение. Содержание KL-6 в сыворотке крови лиц экспозиционной и контрольной групп достоверно не различалось, однако в мокроте были выявлены значительные различия. У экспонированных лиц содержание KL-6 в образцах мокроты было выше, чем в контрольной группе - b=235,9 (95% BCa=21,2-482). Экспрессия KL-6 часто наблюдается при различных заболеваниях лёгочной системы, в том числе сопровождающихся интерстициальными нарушениями и утолщением альвеолярных стенок. Факт выявления повышенного уровня KL-6 именно в мокроте экспонированных лиц заставляет обратить внимание на этот биомаркёр. Учитывая потенциальную асбестоподобную патогенность МУНТ [15] и сходные с асбестом токсикогеномные изменения [6], мы рассматривали остеопонтин в качестве ещё одного кандидата на роль биомаркёра экспозиции к МУНТ. При использовании коммерческого набора для иммуноферментного анализа мы не выявили остеопонтин в образцах мокроты. Наилучшая модель для остеопонтина в сыворотке крови включала достоверный положительный регрессионный коэффициент для сочетанного эффекта возраста и экспозиции, однако бутстреп-интервал включал нуль, что не позволяет говорить о достоверности влияния экспозиции в условиях имевшейся выборки. ВЫВОДЫ Показано наличие реальной ингаляционной экспозиции работников предприятий-производителей к аэрозолю многослойных углеродных нанотрубок. Полученные данные позволяют предположить, что контакт с аэрозолем многослойных углеродных нанотрубок на рабочих местах может приводить к изменению содержания некоторых маркёров фиброгенных изменений в сыворотке крови и образцах индуцированной мокроты. В частности, уровень трансформирующего фактора роста b1 в сыворотке крови и гликопротеина KL-6 в образцах мокроты оказались достоверно зависимыми от экспозиции к аэрозолю многослойных углеродных нанотрубок. Остеопонтин в данном исследовании не проявил себя в качестве информативного показателя, но мы всё же рекомендуем включать его в тест-батареи будущих исследований. Исходя из принципа разумной предосторожности, на предприятиях, производящих и применяющих многослойные углеродные нанотрубки, необходимы внедрение мер контроля содержания их аэрозоля в воздухе рабочей зоны и организация медицинского наблюдения за работниками.
×

About the authors

L M Fatkhutdinova

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

Email: liliya.fatkhutdinova@gmail.com

T O Khaliullin

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

O L Vasilyeva

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

R R Zalyalov

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

I Kh Valeeva

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

I G Mustafin

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

A A Shvedova

National Institute for Occupational Safety and Health, Morgantown, USA

References

  1. Шитиков В.К., Розенберг Г.С. Рандомизация и бутстреп: статистический анализ в биологии и экологии с использованием R. - Тольятти: Кассандра, 2013. - 289 с.
  2. Commission Recommendation of 18 October 2011 on the definition of nanomaterial. - http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CELEX:32011H0696:EN:NOT [электронный ресурс].
  3. Global markets and technologies for carbon nanotubes. BCC Research. Market forecasting. - http://www. bccresearch.com/report/carbon-nantubes-markets-technologiesnan024e.html [электронный ресурс].
  4. Greim H., Borm P., Schins R. et al. Toxicity of fibers and particles. Report of the workshop held in Munich, Germany, 26-27 October 2000 // Inhal. Toxicol. - 2001. - Vol. 13,N 9. - P. 737-754.
  5. Kagan V.E., Khaliullin T., Fatkhutdinova L.M. et al. Biomarkers of occupational exposures to carbon nanotubes in humans // SOT 51st Annual Meeting, San Francisco. - 2012. - P. 101.
  6. Kim J.S., Song K.S., Lee J.K. et al. Toxicogenomic comparison of multi-wall carbon nanotubes (MWCNTs) and asbestos // Arch. Toxicol. - 2012. - Vol. 86,N 4. - P. 553-562.
  7. Kondo T., Hattori N., Ishikawa N. et al. KL-6 concentration in pulmonary epithelial lining fluid is a useful prognostic indicator in patients with acute respiratory distress syndrome // Respir Res. - 2011. - Vol. 12,N 1. - P. 12-32.
  8. Li Y., Karjalainen A., Koskinen H. et al. Serum growth factors in asbestosis patients // Biomarkers. - 2009. - Vol. 14,N 1. - P. 61-66.
  9. Nau G.J., Guilfoile P., Chupp G.L. et al. A chemoattractant cytokine associated with granulomas in tuberculosis and silicosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997. - Vol. 94. - P. 6414-6419.
  10. Nel A., Xia T., Madler L., Li N. Toxic potential of materials at the nanolevel // Science. - 2006. - Vol. 311, N 5761. - P. 622-627.
  11. NIOSH Current intelligence bulletin 65: Occupational exposure to carbon nanotubes and nanofibers. - http://www.cdc.gov/niosh/docs/2013-145 [электронный ресурс].
  12. Paggiaro P.L., Chanez P., Holz O. et al. Sputum induction // Eur. Respir. J. Suppl. - 2002. - Vol. 37. - P. 3-8.
  13. Park E.K., Thomas P.S., Johnson A.R., Yates D.H. Osteopontin levels in an asbestos-exposed population // Clin. Cancer Res. - 2009. - Vol. 15,N 4. - P. 1362-1366.
  14. Pendergrass H.P., Snell J.D., Carroll F.E. Diseases related to asbestos exposure: historical perspective // South Med. J. - 1987. - Vol. 80,N 12. - P. 1546-1552.
  15. Poland C.A., Duffin R., Kinloch I. et al. Carbon nanotubes introduced into the abdominal cavity of mice show asbestos-like pathogenicity in a pilot study // Nat. Nanotechnol. - 2008. - Vol. 3,N 7. - P. 423-428.

Statistics

Views

Abstract: 226

PDF (Russian): 147

Cited-by

CrossRef: 3

  1. Kuijpers E, Pronk A, Kleemann R, Vlaanderen J, Lan Q, Rothman N, et al. Cardiovascular effects among workers exposed to multiwalled carbon nanotubes. Occupational and Environmental Medicine. 2018;75(5):351. doi: 10.1136/oemed-2017-104796
  2. Shvedova AA, Yanamala N, Kisin ER, Khailullin TO, Birch ME, Fatkhutdinova LM, et al. Integrated Analysis of Dysregulated ncRNA and mRNA Expression Profiles in Humans Exposed to Carbon Nanotubes. PLOS ONE. 2016;11(3):e0150628. doi: 10.1371/journal.pone.0150628
  3. Vlaanderen J, Pronk A, Rothman N, Hildesheim A, Silverman D, Hosgood HD, et al. A cross-sectional study of changes in markers of immunological effects and lung health due to exposure to multi-walled carbon nanotubes. Nanotoxicology. 2017;11(3):395. doi: 10.1080/17435390.2017.1308031

Dimensions

Article Metrics

Metrics Loading ...

PlumX


© 2013 Fatkhutdinova L.M., Khaliullin T.O., Vasilyeva O.L., Zalyalov R.R., Valeeva I.K., Mustafin I.G., Shvedova A.A.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.





This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies