Pilot cross-sectional study for potential fibrogenic risk assessment in real multiwalled carbon nanotube aerosol exposure at the workplaces

Full Text

Количество предприятий, на которых хоальвеолярном лаваже [5]. Целью пилотного синтезируют или применяют углеродные на-кросс-секционного исследования была оценка нотрубки (УНТ), растёт из года в год, так как потенциального фиброгенного риска у человепроизводство из лабораторий выходит на про-ка в условиях реальных экспозиций к аэрозолю мышленный уровень. Мировой рынок УНТ до-МУНТ на рабочих местах. стиг 192 млн долларов в 2011 г., есть основания Исследование проводилось на двух предпредполагать рост до 527 млн долларов в 2016 г. приятиях-производителях МУНТ, используюсо среднегодовым темпом 22,4% [3]. В России та-щих один и тот же тип реактора для синтеза. ких предприятий несколько (в Тамбове, Влади-Всего участвовали 25 работников обоих полов в мире, Новосибирске, Калининграде), и их ко-возрасте 18-65 лет, не имеющих хронического личество увеличивается в связи с ростом спроса заболевания органов дыхания, установленного на продукцию. Производства представлены в до начала работы с УНТ. В экспозиционную основном малыми предприятиями, созданны-группу (11 человек) включены работники, имевми на базе вузов и исследовательских учрежде-шие стаж работы в контакте с аэрозолем МУНТ ний. При этом несколько крупных производств на предприятии более 1 года; перечень професнаходится в проектной стадии. сий включал мастеров, специалистов, инже УНТ, состоящие из одного или нескольких неров-конструкторов, ремонтников, научных свёрнутых листов графена, имеют двойствен-сотрудников. Контрольная группа (14 человек) ную природу. Согласно определению Европей-включала людей, не подверженных экспозиции ского союза (2011) [2], они относятся к нанома-к аэрозолю МУНТ, работающих на тех же предтериалам, с другой стороны, морфология УНТ приятиях. позволяет отнести их к волокнам. В настоящее Критерием наличия контакта с аэрозолем время накоплен значительный объём сведений МУНТ на рабочих местах были данные оценки о заболеваниях органов дыхания, развивающих-содержания элементного углерода и обнаружеся от воздействия аэрозолей частиц волоконной ние отдельных нанотрубок и их агломератов природы [4, 14]. Кроме того, наноразмерные методом просвечивающей электронной микроматериалы имеют высокую проникающую спо-скопии в пробах воздуха рабочей зоны. собность и реактогенность [10]. Все это обуслов-Отбор проб воздуха осуществлялся в зоне ливает необходимость опережающих медико-дыхания в течение 90 мин со скоростью биологических исследований УНТ, включая 3 л/мин (270 л воздуха), в том числе с испольоценку потенциального риска для работников зованием циклона для отбора респирабельной и населения в целом. фракции аэрозоля. Проба воздуха отбиралась В исследованиях на мышах нами был обна-на высокочистый кварцевый фильтр, содержаружен профибротический потенциал нативных ние элементного углерода определяли с помопромышленных многослойных УНТ (МУНТ), щью термооптического анализатора (модифипричём гистологическая картина фиброза со-цированный метод NIOSH 5040 [11]). провождалась достоверным дозо-и времязависи-Просвечивающую электронную микроскомым повышением уровня таких биологических пию в сочетании с энергодисперсионной рентмаркёров, как трансформирующий фактор ро-геновской спектроскопией осуществляли после ста b и остеопонтин в сыворотке крови и брон-отбора проб воздуха на фильтры из смешанных эфиров целлюлозы модифицированным методом NMAM 7402 [11] на просвечивающем электронном микроскопе JEOL 2100F. Для проведения пилотного исследования были выбраны наименее инвазивные методы - отбор крови и индуцированной мокроты. Метод индуцированной мокроты заключается в получении образцов мокроты при отсутствии её спонтанного отделения (у здоровых и практически здоровых лиц) путём вдыхания обследуемым аэрозолированного гипертонического раствора, что вызывает увеличение бронхиальной секреции [12]. Данный метод позволяет получать образцы мокроты из глубоких отделов дыхательных путей, при этом являясь неинвазивным и минимально дискомфортным для обследуемых. После центрифугирования отобранных проб и отделения клеточного осадка в супернатанте определяли необходимые показатели. В сыворотке крови и образцах мокроты с применением коммерческих наборов для иммуноферментного анализа определяли содержание трансформирующего фактора роста β1 (TGFβ1), гликопротеина KL-6 (Krebsvonden Lungen-6) и остеопонтина. TGFb - белок, участвующий в пролиферации, клеточной дифференциации, апоптозе и множестве других процессов, а также играющий роль в развитии фиброза, опухолевых заболеваний, сахарного диабета, заболеваний сердечно-сосудистой системы [8]. Муциноподобный высокомолекулярный гликопротеин экспрессируется альвеолоцитами II порядка и клетками бронхиального эпителия человека. Было показано, что содержание KL-6 в сыворотке крови служит маркёром активности течения интерстициальной пневмонии, альвеолярного протеиноза, респираторного дистресс-синдрома и других интерстиционных заболеваний [7]. Остеопонтин экспрессируется в различных гранулёмах, в том числе при силикозе [9]. Кроме того, было показано, что уровень остеопонтина в сыворотке крови может коррелировать с выраженностью фибротических изменений в лёгких при асбестозе [13]. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом Казанского государственного медицинского университета (протокол №14 от 26.12.2011), от работников было получено информированное согласие. Для статистического анализа использовали статистическую среду R. Методами последовательного исключения и полного перебора создавались обобщённые линейные модели (GLM) второго уровня, включавшие как главные эффекты, так и попарные взаимодействия. Отбор моделей осуществлялся на основании оценки критерия информации Акайке (AIC), теста отношения правдоподобия и дисперсионного анализа. Доверительные интервалы регрессионных коэффициентов, полученные на основе малой выборки, уточнялись методом бутстрепанализа, который позволяет многократно извлекать повторные выборки из эмпирического распределения [1]. На основе разброса значений анализируемого показателя, полученного в процессе многократной имитации (1000 псевдовыборок), строились доверительные бутстреп-интервалы (ВСа), на основании которых делали заключение о статистической значимости взаимосвязей. В ходе гигиенической оценки рабочих мест были выявлены основные критические точки производственного процесса, на которых существовала возможность контакта работников с аэрозолированными МУНТ: выгрузка/сбор синтезированных МУНТ из реактора, механическая дезинтеграция на электромельнице, упаковка и фасовка готового продукта, работа с МУНТ в условиях лаборатории. Результаты оценки приведены в табл. 1. Просвечивающая электронная микроскопия показала наличие агломератов МУНТ с максимальными размерами от 0,5 до 10 мкм во всех в отобранных пробах (рис. 1). Агломераты Таблица 1 Оценка содержания элементного углерода (ЭУ) в воздухе рабочей зоны (К) на различных этапах технологического процесса Этап технологического процесса Циклон ЭУ, К разовая, мкг/м3 ЭУ, К среднесменная, мкг/м3 Сбор про + 32,59 6,11 дукта - 157,77 29,60 Дезинтегра + 10,83 2,03 ция продукта - 10,92 2,05 Упаковка + 14,15 2,65 продукта - 134,85 25,30 Работа в лабо + 2,87 0,54 ратории - 3,78 0,71 Таблица 2 Содержание исследуемых биомаркёров в сыворотке крови и мокроте работников Группы работников TGFb, сыворотка, пкг/мл TGFb, мокрота, пкг/мл KL-6, сыворотка, нг/мл KL-6, мокрота, нг/мл Остеопонтин, сыворотка, пкг/мл Экспозиционная группа (n=11) 19,88±1,57 5,00±0,95 293,16±29,46 176,38±107,63 68,98±7,2 Контрольная группа (n=14) 22,05±0,89 4,91±0,34 297,06±37,81 12,2±8,6907 59,19±5,37 Примечание: TGFb - трансформирующий фактор роста β. Рис. 1. Агломераты многослойных углеродных нанотрубок в воздухе рабочей зоны. Изображение, полученное при просвечивающей электронной микроскопии. Слева - участок сбора продукта из реактора. Справа - участок фасовки продукта. представляли собой либо переплетённые нанотрубки и матрикс (аморфный углерод и остатки катализатора), либо клубки нанотрубок. Отдельных нанотрубок обнаружено не было. Результаты определения содержания TGFb, KL-6 и остеопонтина в сыворотке крови и образцах мокроты исследуемых работников представлены в табл. 2. Регрессионные модели строились на основании следующих зависимых переменных: «наличие/отсутствие экспозиции» и кофаундеры - возраст, пол, курение. Наилучшие модели с указанием коэффициентов b, стандартных и бутстреп доверительных интервалов приведены в табл. 3. Гигиеническая оценка подтвердила наличие экспозиции лиц, занятых на производстве МУНТ, к аэрозолю этих наночастиц. Наиболее высокие значения содержания элементного углерода были обнаружены в ходе выгрузки синтезированного продукта из реактора. В силу отсутствия отечественных нормативов полученные среднесменные концентрации сравнивали с уровнем респирабельной фракции, рекомендованным Национальным институтом безопасности и здоровья труда, США (NIOSH) - 1 мкг/м3 [11]. В нашем случае среднесменные концентрации респирабельной фракции в зоне дыхания работника достигали 6,11 мкг/м3 . Это свидетельствует о возможном риске развития патологических состояний в ходе продолжительного контакта с аэрозолем МУНТ. Фактор «экспозиция к МУНТ» вошёл в модель, созданную для содержания TGFb1 в сыворотке крови, с положительным достоверным коэффициентом b=10,47 (95% BCa=1,18-51,75), что свидетельствует о прямой зависимости содержания TGFb1 в сыворотке от контакта с МУНТ. Сочетание «возраст + экспозиция» имело достоверный отрицательный регрессионный коэффициент b=-0,4 [95% BCa=-(2,02-0,08)], то есть в экспонированной группе показатель был выше у более молодых работников. Курение статистически значимо не влияло на содержание этого белка. В модели для TGFb1 в мокроте наблюдались те же тенденции, но доверитель Таблица 3 Описание наилучших регрессионных моделей и их регрессионных коэффициентов β (CI - доверительный интервал, BCa - бутстреп-интервал) Пока Свободный Возраст Экспозиция Возраст + экспозиция Курение затель, член среда уравне b CI BCa b CI BCa b CI BCa b CI BCa ния TGFb, сыворотка 15,41 0,24 (-0,87, 1,35) (-0,03, 0,58) 10,47* (6,07, 14,87) (1,18, 51,75) -0,4* (-0,54, -0,26) (-2,02, -0,08) - - - TGFb, мокрота 2,34 0,1 (0,02, 0,18) (-0,13, 0,19) 0,28 (-2,28, 2,84) (-5,87, 5,67) -0,04 (-0,13, 0,05) (-0,19, 0,24 ) - - - KL-6, сыворотка 221,96 2,67 (-1,47, 6,81) (-8,80, 31,57) -48,7 (-216,31, 118,99) (-354,48, 798,35) 0,52 (-4,52, 5,56) (-34,53, 11,31) - - - KL-6, мокрота 148,85 -5,24* (-7,64, -2,84) (-11,91, 0,58) 235,9** (169,4, 302,4) (21,2, 482) - - - - - - Остеопонтин, сыворотка 98,71 -1,46* (-2,08, -0,84) (-2,30, 1,68) -36,13 (-50,43, -11,87) (-90,78, 44,97) 1,84* (1,08, 2,6) (-1,52, 3,61) 19,2 (1,64, 36,76) (-15,81, 32,75) Примечание: *p <0,05; **p <0,01; TGFb - трансформирующий фактор роста b. ные интервалы регрессионных коэффициентов включали нулевое значение. Содержание KL-6 в сыворотке крови лиц экспозиционной и контрольной групп достоверно не различалось, однако в мокроте были выявлены значительные различия. У экспонированных лиц содержание KL-6 в образцах мокроты было выше, чем в контрольной группе - b=235,9 (95% BCa=21,2-482). Экспрессия KL-6 часто наблюдается при различных заболеваниях лёгочной системы, в том числе сопровождающихся интерстициальными нарушениями и утолщением альвеолярных стенок. Факт выявления повышенного уровня KL-6 именно в мокроте экспонированных лиц заставляет обратить внимание на этот биомаркёр. Учитывая потенциальную асбестоподобную патогенность МУНТ [15] и сходные с асбестом токсикогеномные изменения [6], мы рассматривали остеопонтин в качестве ещё одного кандидата на роль биомаркёра экспозиции к МУНТ. При использовании коммерческого набора для иммуноферментного анализа мы не выявили остеопонтин в образцах мокроты. Наилучшая модель для остеопонтина в сыворотке крови включала достоверный положительный регрессионный коэффициент для сочетанного эффекта возраста и экспозиции, однако бутстреп-интервал включал нуль, что не позволяет говорить о достоверности влияния экспозиции в условиях имевшейся выборки. ВЫВОДЫ Показано наличие реальной ингаляционной экспозиции работников предприятий-производителей к аэрозолю многослойных углеродных нанотрубок. Полученные данные позволяют предположить, что контакт с аэрозолем многослойных углеродных нанотрубок на рабочих местах может приводить к изменению содержания некоторых маркёров фиброгенных изменений в сыворотке крови и образцах индуцированной мокроты. В частности, уровень трансформирующего фактора роста b1 в сыворотке крови и гликопротеина KL-6 в образцах мокроты оказались достоверно зависимыми от экспозиции к аэрозолю многослойных углеродных нанотрубок. Остеопонтин в данном исследовании не проявил себя в качестве информативного показателя, но мы всё же рекомендуем включать его в тест-батареи будущих исследований. Исходя из принципа разумной предосторожности, на предприятиях, производящих и применяющих многослойные углеродные нанотрубки, необходимы внедрение мер контроля содержания их аэрозоля в воздухе рабочей зоны и организация медицинского наблюдения за работниками.

About the authors

L M Fatkhutdinova

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

Email: liliya.fatkhutdinova@gmail.com

T O Khaliullin

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

O L Vasilyeva

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

R R Zalyalov

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

I Kh Valeeva

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

I G Mustafin

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

A A Shvedova

National Institute for Occupational Safety and Health, Morgantown, USA

References

Supplementary files