The development of the blood clotting initiation conceptions: from A.A. Schmidt to D.M Zubairov

Full Text

В первых научных исследованиях свёртыва-ных тканей вещества. Моравитц установил, что ния крови наш соотечественник А.А. Шмидт это вещество - тромбокиназа - также является установил, что в основе этого процесса лежит ферментом [23]. Позднее было установлено, что образование сгустка из белка фибрина, который для свёртывания крови необходимо присутствие вместе с клетками крови закрывает повреждение растворимых солей кальция [21] и липидного сосуда [28]. Фибрин образуется из своего предше-компонента [19]. Во второй половине прошлого ственника - фибриногена - под действием фер-века было установлено, что в свёртывании примента тромбина, возникающего из протромбина. нимают активное участие клетки крови, эндоФибриноген и протромбин постоянно находятся телий сосудов, белки межклеточного матрикса, в крови в растворённом состоянии. Свёртывание а также ряд ранее неизвестных белков плазмы. начинается в момент повреждения сосуда вслед-Выяснилось, что свёртывание крови происходит ствие превращения протромбина в тромбин под в результате реакций сосудисто-тромбоцитарного действием поступающего в кровь из повреждён-и плазменного гемостаза. В сосудисто-тромбоци тарном, или первичном, гемостазе под влиянием Адрес для переписки: svkisilev08@mail.ru различных воздействий (механической травмы, бактериальных токсинов, адреналина, тромбина, аденозиндифосфата и др.) возникает спазм сосудов, и клетки крови и тканей формируют прокоагулянтную фосфолипидную поверхность. Далее в реакциях плазменного гемостаза на фосфолипидной поверхности происходит последовательная активация витамин K-зависимых белковых факторов, заканчивающаяся образованием тромбина, свёртывающего фибриноген. Первоначально считали, что активация плазменных факторов свёртывания может осуществляться по двум путям - внутреннему и внешнему [22]. Во внутренней системе активация происходит на фосфолипидах тромбоцитов и запускается факторами контактного суперкомплекса (фактор ХII, прекалликреин, высокомолекулярный кининоген, фактор ХI) при соприкосновении крови с чужеродной поверхностью. Во внешней системе активация осуществляется особым мембранным белком - тканевым фактором, экспонируемым вместе с необходимыми фосфолипидами на поверхности внешних по отношению к крови тканей. До выяснения последовательности реакций плазменного гемостаза считали, что сохранение жидкого состояния крови в организме обусловлено несмачиваемостью внутренней стенки сосудов [17], вследствие чего в крови не активируется контактный фактор. Однако в 1963 г. Д.М. Зубаиров с сотрудниками показали, что сосудистый эндотелий смачивается кровью [3] и, следовательно, инициирование свёртывания крови не связано с чисто физическим явлением смачивания поверхности. Значение контактного суперкомплекса как необходимого элемента инициирования свёртывания крови было подвергнуто Д.М. Зубаировым сомнению после того, как он установил, что активация фактора ХII происходит на многих отрицательно заряженных поверхностях, а также вызывается различными органическими веществами, в частности катехоламинами [29]. Действительно, позднее многие исследователи подтвердили, что контактная активация не является собственно механизмом инициирования свёртывания крови. Факторы контактного суперкомлекса являются компонентами целого ряда защитных систем организма - свёртывающей, фибринолитической, калликреин-кининовой, системы комплемента и других, и контактная активация служит для сопряжения системы гемокоагуляции с различными регуляторными системами организма. В 80-е годы прошлого века было установлено, что в условиях организма свёртывание крови инициируется главным образом по внешнему пути - тканевым фактором. Он представляет собой специфический мембранный белок вместе с окружающими фосфолипидами, необходимый для проявления активности фактора VII. До выяснения ведущей роли этого белка различными методами (по тромбопластической активности, активности сопутствующего фермента экто-5’нуклеотидазы) было изучено распределение тканевого фактора в различных клетках и тканях [1, 14]. Выяснилось, что тканевой фактор в норме отсутствует на поверхности нестимулированных клеток крови и сосудистого эндотелия и обнаруживается в клетках адвентиция сосудов. Эти данные вместе с аналогичными данными других исследователей позволили Д.М. Зубаирову сделать вывод, что инициирование свёртывания крови связано с предшествующим экспонированием тканевого фактора в результате стимуляции (активации) макрофагов крови и тканей, эндотелиальных клеток сосудов и трансформацией их мембран. Этот вывод следовал также из предшествующих исследований Д.М. Зубаирова и сотрудников. В них было установлено, что тканевой тромбопластин представляет микрочастицы клеточных мембран [4], и что мембраны тромбоцитов и клеток сосудов проявляют прокоагулянтные свойства [5]. Однако оставалось непонятным, почему во многих случаях, несмотря на доказанную экспрессию белкового компонента тканевого фактора (апопротеина III) в клетках, соприкасающихся с кровью, свёртывания крови не происходит. Ещё при изучении состава ферментных комплексов, участвующих в свёртывании крови, было установлено, что для нормального свёртывания необходимо соприкосновение крови с поверхностью, сформированной смесью естественных фосфолипидов с обязательным присутствием некоторого количества фосфатидилсерина [20, 24]. Фосфолипиды связывают витамин K-зависимые факторы свёртывания через ионы Са2+, и сама фосфолипидная поверхность необходима для проявления полной активности ферментных комплексов этих факторов. В то же время выяснилось, что нативным клеточным мембранам присуще асимметричное распределение фосфолипидов в бислое [18]. Фосфатидилсерин почти полностью отсутствует на наружной поверхности плазматических мембран. Он находится на их внутриклеточной поверхности благодаря активному переносу аминофосфолипидов из внешнего слоя мембраны во внутренний специальной ферментной системой. Наружный слой сформирован в основном нейтральными фосфолипидами - фосфатидилхолином и сфингомиелином. В связи с этим представлялось очевидным, что для свёртывания крови необходимо нарушение исходной асимметрии фосфолипидного состава нативных клеточных мембран. Исходя из этого, R. Zwaal и соавт. [30] выдвинули представление об инициировании свёртывания фосфолипидами внутриклеточной поверхности плазматических мембран, приходящей в соприкосновение с кровью при повреждении клеток. Более детально это представление было разработано Д.М. Зубаировым [6]. Он учёл возможность образования смешанных хелатных комплексов из фосфолипидов, ионов Са2+ и остатков γ-карбоксиглутаминовой кислоты витамин K-зависимых факторов и на основе структурных расчётов указал на необходимость взаимно упорядоченного расположения фосфолипидов в обрывках мембран для инициирования свёртывания (матричная теория свёртывания). Сформировавшееся на основе упомянутых выше собственных исследований понимание критически важной роли тканевого фактора и перестройки клеточных мембран в инициировании свёртывания крови вполне логично побудило Д.М. Зубаирова обратиться к изучению структуры тканевого тромбопластина. Тромбопластин представляет промытый ацетоном порошок мозга. Он сохраняет все интегральные белки (в частности, апопротеин III) и фосфолипиды исходных клеточных мембран и является наиболее мощным активатором свёртывания крови. Было установлено, что тромбопластин - конгломерат липопротеиновых комплексов, в котором сохранено немного фрагментов клеточных мембран с типично бислойной структурой. По данным спектроскопии ядерно-магнитного резонанса на ядрах 31Р и 1Н фосфолипиды в водной суспензии тромбопластина организованы в гексагональную лиотропную мезофазу, в водную среду экспонировано 10-20% полярных головок фосфолипидов [7]. Казалось несомненным, что организация фосфолипидов в тромбопластине воспроизводит все существенные черты структуры, необходимой клеточным мембранам в организме для инициирования свёртывания крови. Для выяснения значения структуры фосфолипидной поверхности в обеспечении тромбогенности клеточных мембран было изучено связывание с тромбопластином протромбина человека, продуктов его активации и фактора Х, меченых 125I [8, 10, 13]. Выяснилось, что витамин K-зависимые факторы свёртывания связываются с тромбогенной фосфолипидной поверхностью через ионы Са2+ N-концевым участком своих молекул (доменом γ-карбоксиглутаминовой кислоты). Связывание неоднородно, происходит по высоко- и низкоаффинным центрам. Обнаружение двух типов центров Са2+-опосредованного связывания витамин K-зависимых факторов с тканевым тромбопластином позволило объяснить каталитическое действие фосфолипидной поверхности при свёртывании крови. Низкоаффинные центры представляют собой кластеры фосфатидилсерина. На них происходит подвижное связывание факторов, обеспечивающее их концентрирование на поверхности и латеральную диффузию к высокоаффинным центрам. Высокоаффинные центры представляют также кластеры фосфатидилсерина, но находящиеся на границах мицеллярной и цилиндрической мезофаз, где имеются разрыхления мембраны. Они обеспечивают более прочное связывания факторов с поверхностью и формирование их ферментных комплексов. Активация осуществляется в ансамблях близко расположенных ферментных комплексов факторов VIIa, IXa и Xа с соответствующими белкамикофакторами, что придаёт реакциям активации характер согласованного каскада и значительно ускоряет образование тромба. Также стало понятно, что экспрессия на поверхности клеток белкового компонента тканевого фактора ещё недостаточна для проявления его активности. Необходимо независимое формирование его липидного компонента с участием фосфатидилсерина, происходящее при повреждении или перестройке клеточных мембран. Полученные данные означали, что приобретение клеточными мембранами тромбогенных свойств связано с утратой ими исключительно бислойной структуры и образованием мезоморфной структуры с экспонированным фосфатидилсерином. Этот вывод был подтверждён и данными других исследователей [26, 27]. Вместе с тем оставалось непонятным, каким образом совершенно различные воздействия на уровне организма (действие биологически активных веществ, бактериальных токсинов, кровопотеря, физическая травма и др.) приводят к однотипному эффекту - повышению прокоагулянтного потенциала крови и генерации тромбина. Это несоответствие оказалось кажущимся и разъяснилось в функциональной концепции инициирования свёртывания крови Са2+-опосредованной перестройкой клеточных мембран, разработанной Д.М. Зубаировым вместе с В.Н. Тимербаевым [9]. В ней были учтены результаты собственных исследований и последние данные о сигнальных механизмах клетки, фазовой структуре фосфолипидов и механизмах поддержания устойчивости клеточных мембран. Свёртывание крови вызывают различные физические, химические и бактериальные воздействия на клетки, соприкасающиеся с кровью в норме или при патологии. Из клеток, соприкасающихся с кровью, первостепенное значение имеют эндотелиальные клетки, тромбоциты и моноциты, а из внесосудистых клеток - фибробласты, перициты и мышечные клетки. Информационные молекулы физиологического характера (тромбин, коллаген, тромбоксаны, фактор активации тромбоцитов, аденозиндифосфат, катехоламины и др.) регулируют тромбогенные свойства клеток через специфические рецепторы. При ограниченном действии таких веществ за несколько часов значительно возрастают синтез и экспрессия клетками белкового компонента тканевого фактора. Патологические воздействия (бактериальные токсины, цитокины, физическая травма) оказывают своё воздействие, грубо повреждая клеточную мембрану. Во всех случаях воздействие тромбогенного сигнала ведёт к дозированному (через Са2+-мобилизующие сигнальные механизмы) или недозированному поступлению ионов кальция в цитоплазму из внутриклеточных депо или внеклеточной жидкости и крови. Ионы кальция блокируют ферментную систему, переносящую фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин с наружной стороны мембраны на внутреннюю, а также систему напряжения мембраны каркасом из белков цитоскелета. При достаточной силе сигнала это приводит к быстрому (в течение 1-2 мин) равновесному перераспределению фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина между внутренним и внешними слоями мембраны. При этом они соприкасаются с межклеточной жидкостью или кровью, в которой содержание ионов кальция более чем в 10 000 раз превышает его концентрацию в цитоплазме. При такой высокой концентрации ионы Са2+ стабилизируют компактные группировки молекул фосфатидилсерина - кластеры - за счёт связывания с ним в хелатные комплексы. Это ведёт к относительному обогащению соседних участков мембраны фосфатидилэтаноламином. Однако его молекулы имеют форму конуса, не подходящую для самостоятельного формирования устойчивого бислоя. По этой причине они склонны переворачиваться и образовывать свою собственную мезофазу с обращённой мицеллярной или цилиндрической структурой. Таким образом, ионы Са2+ индуцируют перестройку бислойной структуры мембраны в гетерофазную, в которой участки бислоя чередуются с другими мезофазами. Это ведёт к появлению межфазных дефектов, разрыхлению и понижению прочности мембраны. При ограниченной стимуляции перестраиваются только отдельные участки плазматической мембраны, так что поверхность клеток становится тромбогенной без нарушения их целостности. При нарастании структурных изменений рассмотренный процесс может привести к отшнуровыванию и отторжению в кровоток массы фосфолипопротеиновых частиц, обладающих выраженной тромбопластической активностью. Перестройка мембран, приобретение ими гетерофазной структуры превращает их в матрицы для взаимно ориентированного связывания и активации витамин K-зависимых факторов в ансамблях их ферментных комплексов, а также формирует с ранее экспрессированным апопротеином III полноценный тканевой фактор, то есть «раскрывает» его активность. Рассмотренная концепция впервые охватывала все известные данные об инициировании свёртывания крови и его развитии в их причинно-следственной взаимосвязи. Гемостаз был представлен как единый механизм, инициируемый на клеточном уровне через типичные рецепторно-сигнальные системы с конкретными молекулярными реакциями сопряжения его сосудисто-клеточного и плазменного этапов. Однако в своём первоначальном виде (1991) данная концепция оставляла неясным механизм появления первой активной молекулы витамин K-зависимых факторов. Они синтезируются в виде неактивных предшественников (проферментов), поэтому фазовая перестройка клеточных мембран сама по себе, казалось бы, ещё недостаточна для инициирования свёртывания крови. Было установлено, что активные формы витамин K-зависимых факторов в минимальном количестве всегда присутствуют в крови. Так, фактор VIIа после местного тромбообразования сохраняется в крови в течение нескольких часов [25]. Самодостаточность рассмотренной концепции инициирования свёртывания крови и постоянное наличие в крови активных форм витамин K-зависимых факторов были обоснованы В.Н. Тимербаевым по данным его исследований аутоактивации и распада протромбина [15, 16]. Отрицательно заряженные кислотные остатки фосфолипидов на трансформированной клеточной поверхности при участии хелатированных ионов Са2+ должны вызывать неферментативное расщепление витамин K-зависимых факторов по доступным остаткам аргинина, что имитирует их ферментативное расщепление при естественной активации. Этот процесс с неизбежностью должен осуществляться благодаря уникальной структуре этих факторов - наличию остатков γ-карбоксиглутаминовой кислоты, обеспечивающих Са2+-опосредованное связывание этих белков с отрицательно заряженными кластерами фосфатидилсерина на фосфолипидной поверхности. Биоимитирующий неферментативный протеолиз витамин K-зависимых факторов на гетерофазных фосфолипидных поверхностях старых, повреждённых и стимулированных клеток обеспечивает постоянное наличие их активных форм в крови, а также запуск каскада их ферментативных превращений (активацию) на аналогичной поверхности большого массива клеточных мембран при тромбообразовании. Таким образом, индуцированная тромбогенными сигналами через рецептор-зависимые механизмы функциональная перестройка бислойной структуры клеточных мембран в гетерофазную структуру является достаточной и исчерпывающей для инициирования свёртывания крови как по внешнему, так и по внутреннему пути. Следует отметить, что Д.М. Зубаиров вполне отчётливо понимал, что контакт с кровью небольшого количества клеток с перестроенной плазматической мембранной или даже фосфолипидных микрочастиц с экспонированным апопротеином III ещё не должен приводить к свёртыванию крови [11]. Многие из упомянутых выше индукторов тромбиногенеза постоянно возникают в организме, обеспечивая фоновый уровень стимуляции клеток. Физиологические микротравмы и естественное старение также способствуют появлению клеток с тромбогенной поверхностью. При старении клеток, например, уменьшается эффективность системы поддержания асимметрии фосфолипидного состава мембран с появлением в конечном итоге на их поверхности фосфатидилсерина. Экспериментальные данные подтверждали, что в крови и тканях в норме всегда в определённом количестве есть клетки с тромбогенной поверхностью и фрагменты их мембран в виде фосфолипидных микрочастиц, обеспечивающих обычный уровень прокоагулянтной активности крови и тканей. Однако накопления тромбогенных клеток и частиц сверх определённого уровня не происходит. Это обусловлено тем, что макрофаги крови и тканей опознают на их поверхности фосфатидилсерин, атакуют их и удаляют из циркуляции. Активные молекулы витамин K-зависимых факторов в минимальном количестве также всегда присутствуют в крови. Однако в норме их недостаточно для инициирования плазменного гемостаза. Они эффективно нейтрализуются совместным действием факторов противосвёртывающей системы - гликозаминогликанов на поверхности эндотелиальных клеток, гепарина и антитромбина III, ингибитора внешнего пути свёртывания и плазменных ингибиторов протеаз. Таким образом, в норме кровь остаётся жидкой, несмотря на постоянно происходящую фазовую перестройку плазматических мембран у некоторого количества контактирующих с ней клеток. Действие индуцирующего свёртывание сигнала имеет пороговый характер. Свёртывание крови начинается лишь в тот момент, когда количество соприкасающихся с ней клеток с перестроенной плазматической мембраной и отделившихся от них фосфолипидных микрочастиц достигло порогового уровня. Величина такого порога определяется отдельно для внутреннего и внешнего вариантов инициирования свёртывания концентрацией неактивных факторов в крови и кинетическими параметрами активных ферментных комплексов. Известно, что апопротеин III постоянно экспонирован на поверхности фибробластов и макрофагов многих тканей. Экспрессия его может быть индуцирована в течение нескольких часов в эндотелиальных клетках и моноцитах различными агонистами - тромбином, бактериальным эндотоксином, гистамином и др. При этом повышается тромбопластическая активность тканей. Изменение порога индукции внешнего пути в результате изменений синтеза и экспрессии на поверхности клеток апопротеина III и создание подпороговой концентрации клеток и частиц с мезоморфной фосфолипидной поверхностью представляется главным путём регуляции организмом прокоагулянтного потенциала крови и тканей. Трансформация структуры фосфолипидных клеточных мембран индуцируется независимо от синтеза и экспрессии апопротеина III и является «спусковым крючком» свёртывания крови при любом поддерживаемом на данный момент прокоагулянтном потенциале. Исходя из идеологии рассмотренной концепции инициирования свёртывания крови, Д.М. Зубаиров в последние годы сосредоточил своё внимание на изучении разнообразных эффектов и последствий, вызываемых в организме фазовой перестройкой клеточных мембран и поступлением в кровь тромбогенных фосфолипидных частиц - микровезикул [12]. Ещё ранее в приоритетных исследованиях вместе с сотрудниками он показал, что в плазме крови существуют липопротеидные микрочастицы, проявляющие тромбопластическую активность [2, 4]. Теперь, при более глубоком теоретическом понимании, руководимый Д.М. Зубаировым коллектив в ряде исследований выявил патогенетическую роль тромбогенных микровезикул в развитии синдрома диссеминированного внутрисосудистого свёртывания крови, инфаркта миокарда, лейкозов, аутоиммунных и инфекционных заболеваний. Из изложенного можно видеть, что усилия Д.М. Зубаирова по выяснению механизма инициирования свёртывания крови были последовательны. Они соответствовали его стремлению к пониманию естественной логики изучаемых явлений на молекулярном уровне. Теперь разрозненные представления прежних лет об этом процессе складываются в более ясную картину с отчётливой причинно-следственной взаимосвязью её элементов. Без преувеличения можно считать проблему инициирования свёртывания крови в основных чертах разрешённой. Мы считаем, что это достижение является главным, наиболее значимым вкладом профессора Д.М. Зубаирова в учение о свёртывании крови и ставит его в один ряд с учёными, заложившими основы современной биологии и медицины. ЛИТЕРАТУРА Андрушко И.А. Тромбопластическая активность разных слоёв сосудистой стенки при лучевой болезни // Бюлл. эксп.

About the authors

V N Timerbaev

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

S V Kiselev

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

Email: svkisilev08@mail.ru

References

Supplementary files